Получение протопластов

Клеточная инженерия

Основным объектом клеточной инженерии являются протопласты.Они представляют собой растительные животные или иные клетки, полностью лишенные клеточной оболочки, но сохраняющие способностью осуществлять активный метаболизм, а также реакции биосинтеза и трансформации энергии. Их внутриклеточное содержимое ограниченно только цитоплазматической мембраной. Поэтому протопласты являются уникальной моделью для цитологических и биохимических исследований, и получения новых не существующих в природе организмов с необычными свойствами..

Получение протопластов

Впервые протопласты растительных клеток были получены при изучении плазмолиза (в 1892 г.) в клетках водного растения – телореза. Способ получения был весьма простым (если не сказать примитивным). Тонкая полоска ткани растения выдерживалась сначала в 0,1 М растворе сахарозы до тех пор, пока протопласт не «сожмется» и не отойдет от клеточных стенок, затем бритвой делался разрез полоски, и протопласты высвобождались в среду. Такого рода методические приемы выделения протопластов получили название механических. Подобные методы имеют определенные ограничения: 1) с помощью их можно получить только небольшое количество протопластов; 2) можно использовать только те ткани, в клетках которых при данном способе может иметь место выраженный плазмолиз; 3) из зрелой ткани таким методом протопласты получаются с большим трудом; 4) метод довольно длительный и трудоемкий.

Принципиально отличающимся методом является ферментативный способ получения протопластов, при котором клеточная стенка удаляется с помощью ферментов. Таким методом уже в 1919 г. были получены протопласты клеток грибов в результате обработки их клеточных стенок ферментным комплексом, содержащимся в желудочном соке виноградной улитки Helix pomatia.Некоторые виды актиномицетов так же способны продуцировать ферменты лизирующие оболочки различных эукариотических клеток, в частности грибов. В микробиологических экспериментах протопласты получались путем разрушения клеточных стенок бактерий ферментом лизоцимом, выделяемым из белка куриных яиц. Изолирование протопластов растительных клеток с использованием ферментных препаратов было осуществлено в I960г. Е. Коккингом (Великобритания). Для получения протопластов наиболее пригодны клетки находящиеся в логарифмической стадии (Log-фазе) роста клеточной культуры.

По сравнению с механическими способами ферментативные методы получения протопластов имеют определенные преимущества:

1) можно одновременно получить большое количество протопластов;

2) формирующиеся протопласты не подвергаются сильному осмотическому

сжатию;

3) клетки остаются менее поврежденными;

4) метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки при получении растительных протопластов используются ферментные препараты трех типов – целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Действие этих ферментов состоит в деструкции основных компонентов клеточной стенки, обеспечивающих ее механическую прочность (ригидность). У растительных клеток этими компонентами являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества, которые находятся в клеточной стенке в различных соотношениях. Поэтому комбинации ферментных препаратов и их количественные соотношения и время обработки должны эмпирически подбираться для каждого конкретного случая (т.е. в зависимости от вида растения, его возраста и органа, из которого берется материал для получения протопластов). Формирующиеся протопласты должны находиться в контакте с ферментами минимальное время, после чего их необходимо тщательно отмыть. При этом на всех стадиях необходимо поддерживать жесткие асептические условия. Стерилизация используемых ферментных растворов производится, как правило, путем фильтрования через бактериальные фильтры. Поскольку протопластированные клетки лишены жесткой оболочки, то они становятся очень чувствительными к перепадам концентраций различных веществ внутри клетки и снаружи, в культуральной среде (осмотический шок). Поэтому для отмывки от ферментов нельзя использовать дистиллированную воду, а культивирование протопластов осуществляют на специально подобранных, так называемых гипертонических средах, содержащих различные осмотические стабилизаторы (обычно сорбитол, маннитол в концентрации примерно 125 мг/л). Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны и другие условия. Например, протопласты чаще всего получают в темноте или при слабом освещении. Температурные условия могут варьировать в пределах; 22-28⁰С, стабильности протопластов в определенной степени способствуют высокие концентрации двухвалентных ионов кальция и магния, воздействующих на мембранные системы клетки. Значение рН среды для культивирования протопластов должно быть в проделах 5,5-5,8. Уменьшение рН среды до 3.5 приводит к быстрому (за несколько минут) разрушению и гибели протопластов большинства видов растений.