Интеграция чужеродной ДНК в хромосому хозяина

Наряду с достоинствами использование рекомбинантных плазмиид имеет целый ряд существенных недостатков, связанных с возможностью их утраты клетками в процессе длительного культивирования.

Это обусловлено тем, что при наличии в клетке чужеродной химерной плазмиды часть энергети­ческих и материальных (аминокислоты, нуклеотиды) ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез чужеродных белков, которые она ко­дирует. Чем больше количество таких плазмид в клетке, тем больше клеточных ресурсов уходит на обеспечение процессов не нужных для ее нормальной жизнедеятельности. Поэтому в процессе роста популяции, клетки содержащие меньшее количество плазмид или потерявшие их совсем растут и размножаются бы­стрее тех, в которых они сохранились на прежнем уровне, и, в конеч­ном счете, оказываются в культуре преобладаю­щими.

В результате по прошествии нескольких генераций количество синтезируемого продукта клонированного гена может значительно уменьшится или он вообще перестанет вырабатываться. Разработано, по крайней мере, два подхода к решению этой про­блемы. В лабораторных условиях для сохране­ния рекомбинантных плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечиваю­щих рост только тех клеток, в которых есть такие плазмиды. Однако добавление антибиотиков и каких-то других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные фер­ментеры приводит к значительному удорожа­нию конечного продукта.

Особенно важно, что­бы клонированные гены сохранялись, не передаваясь другим микроор­ганизмам за счет коньюгации плазмид, в том случае, когда сконструирован­ный микроорганизм предназначен для исполь­зования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть эко­логически безопасным.

Методом, позволяюшим избежать утраты или нежелательной коньюгации клонируемого гена является включение клониро­ванной ДНК непосредственно в хромосомную ДНК хозяйского организма.

При встраивании нужного гена в хромосом­ную ДНК хозяина нужно позаботиться о том, чтобы сайт интеграции не находился внутри ге­на, кодирующего важную клеточную функцию. Для этого чужеродный ген включают в заведомо несущественный участок. Кроме того, для обеспе­чения эффективной экспрессии его помещают под контроль регулируемого промотора. Для ин­теграции в нужный сайт вводимый ген должен содержать нуклеотидную последовательность длиной не менее 50 нуклеотидов, сходную с та­ковой в хромосомной ДНК, в пределах которых и должен произойти физический обмен (реком­бинация) между двумя молекулами ДНК.

Химерные белки

Очень часто, даже после успешного клонирования и подбора эффективных условий для экспрессии, чужеродные белки, особенно не­большие, обнаруживаются в клетках лишь в минимальных коли­чествах. Такой кажущийся низкий уровень экс­прессии кодирующих их генов во многих случа­ях объясняется быстрой деградацией этих чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присое­динении продукта клонированного гена к како­му-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название «химерный белок», продукт клониро­ванного гена оказывается защищенным от рас­щепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов.

Слияние белков программируется на уровне ДНК лигированием кодирующих участков соот­ветствующих генов.

Другим способом стабилизации белков является включение, генно-инженерными методами, в целевые белки нескольких дополнительных аминокислот в определенной последовательности (маркерные пептиды), которые обычно присоединяют к N-концу полипептидной цепи. Однако этот способ не всегда эффективен.

Перспективным является так же использование мутантных штаммов с искусственно вызванным дефицитом протеолитических ферментов.

И, наконец эффективным способом сохранения клонированных белков является стимулирование их эффективной секреции из клетки.