Репликация ДНК. Экспрессия генетической информации.

Полуконсервативный механизм репликации ДНК. Перед каждым делением клетки в ней должно удвоиться содержание ДНК, чтобы каждая дочерняя клетка получила полный набор хромосом. Основу каждой хромосомы образует одна двухцепочечная молекула ДНК. Предложенная Дж. Уотсоном и Ф. Криком модель строения ДНК форме регулярной двойной спирали сразу же позволила понять принцип копирования ДНК. Ее репликация происходит полуконсервативным способом: две исходные цепи материнской ДНК расходятся, и каждая из них становится матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Таким образом, каждая новая двойная спираль ДНК содержит одну старую и одну новую цепь. Такой механизм репликации ДНК, при котором от одного поколения к другому передается одна из двух материнский цепей ДНК, получил название полуконсервативного и был экспериментально доказан в 1958 году М. Мезельсон и Ф. Сталь.

Легко представить, что удвоение ДНК происходит вследствие того, что цепи расходятся и каждая цепь служит матрицей для синтеза новой комплементарной цепи ДНК. Каждая дочерняя молекула состоит из одной старой материнской и одной новой синтезированной цепи ДНК.
Общие принципы репликации ДНК.

В основе процесса репликации лежит принцип копирования материнской цепи ДНК с образованием двух идентичных молекул ДНК. В основе синтеза новой цепи ДНК лежит принцип комплементарности азотистых оснований, т.е. последовательность нуклеотидов материнской цепи определяет последовательность нуклеотидов в синтезируемой цепи ДНК

Синтез новых цепей ДНК идет в направлении 5’ → 3’.

В основе репликации ДНК лежат принципы антипараллельности и униполярности. Синтез новых цепей ДНК идет в направлении от 5’-конца к 3’ - концу, при этом ДНК-полимеразы – ферменты, синтезирующие новые цепи ДНК, - добавляют нуклеотиды к 3’- концу наращиваемой цепи ДНК. При этом матричная цепь имеет противоположную ориентацию: 3’ → 5’, т.е. ДНК-полимеразы могут передвигаться вдоль матрицы только в направлении от 3’ к 5’-концам.

Реакция синтеза полинуклеотидной цепи ДНК.
Механизмы синтеза ДНК хорошо изучены в клетках бактерий, однако имеются доказательства, что в клетках эукариот процесс протекает аналогичным образом.
Инициация репликации ДНК. Репликация начинается в специфическом участке молекулы ДНК, который называется точка начала репликации или ориджин.
Точка начала репликации (origin) – это участок молекулы ДНК со специфической последовательностью нуклеотидов с большим содержанием пар АТ (последовательность 300 п.н., богата АТ). Специальные инициирующие белки необходимы для связывания ферментов репликации с молекулой ДНК: белок DnaA – для прокариот белок RPA (replication protein A) – для эукриот.

Кольцевая хромосома прокариот имеет одну точку начала репликации, которая

называется OriC. В этой точке цепи расходятся и образуются две репликативные вилки, которые движутся в противоположном направлении. Скорость синтеза ДНК в клетках прокариот составляет 500 нукл./сек. Две вилки встречаются на противоположной стороне кольца. В клетках прокариот существует специальный фермент гираза (топоизомераза II), который разделяет две образующиеся кольцевые молекулы ДНК. Антибиотик налидиксовая кислота угнетает размножение бактерий, путем инактивации гиразы.

В клетках эукариот этот фермент отсутствует, поэтому налидиксовую кислоту используют в клинической практике для лечения бактериальных инфекций.

Репликация ДНК эукариот начинается одновременно во многих точках начала репликации, от каждой точки движутся две репликативные вилки в противоположных направлениях. Скорость синтеза молекул ДНК эукариот составляет 50 нукл./сек.

Репликон – фрагмент молекулы ДНК, репликация которого происходит под контролем одной точки начала репликации. Кольцевая хромосома прокариот имеет 1 репликон. Геномы эукариот содержат сотни и тысячи репликонов.
Инициация - образование репликативной вилки. Нити ДНК разделяются благодаря действию специальных ферментов и белков.
Хеликаза (от англ. helix – спираль) - основной фермент, расплетающий цепи ДНК. У прокариот он называется белок DnaB. Хеликаза разрывает водородные связи между комплементарными основаниями, используя энергию АТФ.
Топоизомеразы – ферменты, которые устраняют положительные сверхвитки перед репликативной вилкой. Эти ферменты временно разрывают нити материнской ДНК в двойной спирали перед репликативной вилкой, после завершения процесса нити ДНК восстанавливают целостность.
SSB - белки – это белки, которые связываются с одноцепочечной ДНК и удерживают матрицу. В результате образуется репликативная вилка, где и происходит синтез новых цепей ДНК.
Механизм действия ДНК-полимераз. Ферменты, катализирующие процесс синтеза новых цепей ДНК называются ДНК-зависисмые ДНК-полимеразы. В клетках бактерий существует три типа ДНК-полимераз: ДНК-полимераза I, II, III.
Синтез ДНК в репликативной вилке катализирует ДНК-полимераза III. ДНК-полимераза I играет важную роль в синтезе отстающей цепи и репарации ДНК. ДНК-полимераза II участвует в репарации ДНК.
Реакция синтеза. ДНК-полимеразы могут только удлинять (элонгировать) уже существующую полинуклеотидную нить, которую называют затравкой или праймером. В клетках роль затравки играет олигонуклеотид РНК (РНК-праймер), который комплементарен матрице и образует с ней двухспиральныйкомплекс матрица-затравка. Синтез РНК праймера осуществляет фермент праймаза. Затем ДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК, используя 3’-OH конец праймера. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются с помощью ферментов – экзонуклеаз.

ДНК-полимераза имеет 2 субстрата: Комплекс матрица – затравка и дезоксинуклеозидтрифосфаты (АТФ, ГТФ,ЦТФ и ТТФ). Реакция осуществляется как удлинение цепи с 3’- конца затравки. Необходимы ионы Mg ²⁺ (3’ – OH) конец полинуклеотидной цепи атакует α-фосфат дНТФ, образуя фосфодиэфирную связь . Матрица копируется точно на основе принципа комплементарности.

Кроме полимеризующей активности, ДНК-полимеразы обладают корректирующей активностью: они дважды проверяют нуклеотид, который добавляют в растущую цепь ДНК. Корректирующая активность ДНК-полимераз проявляется в способности отщеплять нуклеотид, некомплементарный матрице, и замещать его комплеметарным нуклеотидом.
Асимметричность репликативной вилки. Поскольку ДНК-полимераза наращивает цепь ДНК в направлении 5’ → 3’, синтез дочерних цепей идет в противоположном направлении. Одна цепь синтезируется непрерывно (лидирующая), а другая синтезируется прерывисто, в виде фрагментов Оказаки (отстающая). Фрагменты Оказаки – это короткие цепочки ДНК вместе с РНК-праймерами, расположенные на отстающей цепи.
Синтез отстающей цепи. ДНК-полимераза III останавливается перед РНК-праймером предшествующего фрагмента Оказаки. Здесь подключается ДНК-полимераза I, которая удаляет РНК-праймеры предшествующего фрагмента Оказаки и одновременно наращивает 3’-OH – конец растущей цепи ДНК, заполняя образующуюся брешь. Фермент лигаза соединяет два фрагмента Оказаки, используя АТФ. Таким образом, на отстающей цепи также синтезируется непрерывная цепь ДНК.

Функции теломераз.
Проблема недорепликации 3’-концов линейных молекул ДНК заключается в том, что удаление последних РНК-праймеров с 5’-концов обеих цепей дочерней ДНК, приводит к тому, что дочерние цепи оказываются короче материнской на 10-20 нуклеотидов (у организмов разных видов размер РНК-праймеров различен). Проблема недорепликации 3’-концов линейных молекул ДНК эукариот решается с помощью специального фермента – теломеразы.
В случае репликации кольцевых молекул ДНК этой проблемы не существует, т.к. первые РНК-затравки удаляются ДНК-полимеразой I, которая одновременно наращивает 3’-OH – конец растущей цепи ДНК и заполняет образующуюся брешь.

Ограничение числа клеточных делений. Лимит Хейфлика.

Американский ученый Л. Хейфлик в начале 60-х годов 20 века показал, что культивируемые клетки новорожденных детей могут пройти 80-90 делений, в то время как соматические клетки 70-летних людей делятся 20-30 раз. Такое явление ограничения числа клеточных делений называют “лимитом Хейфлика”.

В 1971 г. А.М. Оловников в своей теории маргинотомии (от лат. marginalis – краевой, toma - сечение) предположил, что последовательное укорочение ДНК хромосом во время репликации лежит в основе ограниченного числа делений, которое наблюдается у нормальных соматических клеток, растущих в культуре in vitro. Позже был обнаружен фермент теломераза, активный в стволовых, половых и раковых клетках, которые способны к бесконечному делению.
Функции теломеразы.
Фермент теломераза впервые был обнаружен в 1985 году у равноресничной инфузории Tetrahymena thermophila, а позже – в клетках дрожжей, растений и животных, в том числе в яичниках человека и иммортализованных (бессмертных) линиях раковых клеток HeLa.

Согласно номенклатуре этот фермент называют теломерной терминальной трансферазой. Теломераза выполняет функции ДНК-полимеразы, которая достраивает 3’-концы линейных молекул ДНК короткими повторяющимися последовательностями нуклеотидов (у позвоночных – ТТАГГГ) в отсутствии ДНК матрицы. В качестве матрицы для синтеза цепи ДНК теломераза использует молекулу РНК, которая является составной частью этого фермента.
Механизм действия теломеразы. В результате того, что после каждой репликации дочерние цепи ДНК оказываются короче материнских на размер первого РНК-праймера (10-20 нуклеотидов), образуются выступающие однонитевые 3’-концы материнских цепей. Они узнаются теломеразой, которая последовательно наращивает материнские цепи на сотни повторов ТТАГГГ, используя 3’- конец материнской цепи ДНК в качестве праймера, а входящую в состав фермента молекулу РНК использует в качестве матрицы. Образующиеся длинные однонитевые концы материнской ДНК в свою очередь служат матрицей для синтеза дочерних цепей по традиционному механизму репликации.