СТРУКТУРНЫЕ СХЕМЫ ФОТОМЕТРОВ

Фотометр

Фотометр — оптический прибор, позволяющий измерять световой поток на фиксированных длинах (диапазонах) волн. Основные ком­поненты одноканального (однолучевого) фотометра показаны на ри­сунке 9.1.

Свет от источника излучения проходит через входную щель и по­падает на светофильтр, который пропускает узкую область спектра, необходимую для измерения. Свет попадает на кювету с образцом, частично, в зависимости от количества исследуемого вещества, погло­щается в кювете. Прошедший через кювету свет отделяется на выход­ной щели от рассеянного света. На фотоприемнике световой поток преобразуется в электрический сигнал, который измеряется микропро­цессором. Величина прошедшего через кювету света зависит от соста­ва и количества вещества в кювете. Как указывалось выше, в одноканальном фотометре измерение холостой пробы, калибратора, опытных проб и контролей проводится последовательно, в двухканальном фотометре измерение может проводиться по схеме компенсации, т. е. постоянного сравнения с бланком (холостой пробой).

Рис. 9.1. Основные компоненты одноканального фотометра.

Особенности фотометрической

схемы биохимических анализаторов

Основой функционирования биохимического анализатора является получение избыточной информации, из которой компьютер с мощным программным обеспечением отбирает необходимые данные. Для по­лучения многопараметрической информации биохимические анализа­торы оснащены, как правило, полихроматорами (рис. 9.3), кото­рые позволяют одновременно регистрировать оптическую плотность исследуемых растворов на нескольких длинах волн.

В биохимических анализаторах измеря­ются многократно многочисленные кюветы с пробами по нескольким спектральным характеристикам, а компьютер по заданной программе выбирает необходимые сигналы и на основе анализа их изменения рассчитывает концентрацию или активность аналитов.

Рис. 9.3. Типичная схема основных узлов фотометрического блока биохимического анализатора.

Использование нескольких фотодиодов, регистрирующих одновременно сигналы разных частей спектра, является основным компонентом полихроматора.

Источник света (как правило, галогеновая лампа) находится внут­ри карусели с измерительными кюветами, в которых содержатся про­бы для измерения. Карусель через фиксированные промежутки вре­мени, примерно через 20 с, совершает оборот, при котором все кюве­ты освещаются белым светом, проходящим через входную щель. Таким образом, каждые 20 с все кюветы, находящиеся на карусели, фотометрируются белым светом, причем часть из кювет может быть пустой или моется в этот период, тем не менее, данные о них поступают в компь­ютер (но не анализируется). Прошедший через кювету свет разлагает­ся на решетке в спектр и измеряется серией (до 12 штук) детекторов, каждый из которых настроен на определенную длину спектра, вклю­чая измерение в ультрафиолете и ближнем инфракрасном диапазоне (полихроматор). Компьютер анализирует результаты измерений всех детекторов, представляет результаты в конечном виде, кроме того, ком­пьютер через соответствующие датчики контролирует работу практически всех узлов анализатора.

Спектрофотометр

Спектрофотометр — оптический прибор, который разлагает световой поток на непрерывный спектр и позволяет измерять его на любой длине волны в пределах оптического диапазона. В качестве диспергирующего устройства, разлагающего свет на монохроматический, используется диспергирующая призма или дифракционная решетка.

Последовательность и месторасположение отдельных оптических элементов и систем на пути следования светового потока от источника света до детектора излучения в том или ином спектрофотометре характерны для данного прибора. Существенным для спектрофотометра является возможность непрерывной регистрации спектра, разрешающая способность.

Рис. 9.2. Основные компоненты спектрофотометра.

Основные элементы спектрофотометра представлены на рис. 9.2. Свет пропускается через монохроматор, чтобы обеспечить выбор желательной области спектра, которую нужно использовать для изме­ниий. Щели нужны, чтобы выделить узкий луч света и, тем самым, улучшить цветную чистоту. Свет затем проходит через поглощающую ячейку (кювету), где часть излучательной энергии поглощается, в зависимости от природы и концентрации раствора. Непоглощенный свет попадает на фотоприемник (фотоэлемент, фотоумножитель, фотодиод и др.), преобразующий энергию излучения в электрический сингнал, величина которого может быть зарегистрирована измерительным устройством и выведена на стрелочный или цифровой индикатор.

Таким образом, в фотометрах и спектрофотометрах происходит се­лекция светового сигнала, отражающего концентрацию субстрата или активность фермента в пробе.

СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ

Линейчатые спектры играют особо важную роль, так как их струк­тура прямо связана со строением атома. Эти спектры создаются ато­мами, не испытывающими внешних воздействий.

Главное свойство линейчатых спектров состоит в том, что длины волн (или частоты) линейчатого спектра вещества зависят только от свойств атомов этого вещества и не зависят от способа возбуждения свечения атомов. Атомы любого химического элемента дают спектр, не похожий на спектры всех других элементов: они способны излучать строго определенный набор длин волн.

На этом основан спектральный анализ — метод определения хими­ческого состава вещества по его спектру. С помощью спектрального анализа можно обнаружить данный элемент в составе сложного веще­ства, если даже его масса не превышает 10 М. Это очень чувствитель­ный метод. Изучают спектры с помощью спектрометров.

Количественный анализ состава вещества по его спектру затруд­нен, так как яркость спектральных линий зависит не только от массы вещества, но и от способа возбуждения свечения. Так, при низких тем­пературах многие спектральные линии вообще не появляются. Одна­ко при соблюдении стандартных условий возбуждения свечения мож­но проводить и количественный спектральный анализ.

В настоящее время определены спектры всех атомов и составлены таблицы спектров. Благодаря сравнительной простоте и универсаль­ности спектральный анализ является основным методом анализа со­става сложных, главным образом органических смесей. Спектральный анализ получил широкое распространение в токсикологии, кримина­листической медицине, при исследовании микроэлементов в тканях и жидкостях организма.

ЭМИССИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ

Неповторимость спектров атомов позволяет изучать состав веществ методом эмиссионной спектроскопии. Этот метод заключается в энер­гетическом возбуждении атомов и наблюдении спектров их излучения с помощью спектрометров (приборов для определения длин волн из­лучения). Для испарения и возбуждения атомов, содержащихся в твер­дых телах, очень эффективными средствами являются электрические разряды — электродуговые и электроискровые. Когда в электрическую дугу вводят какое-либо вещество, составляющие его элементы под дей­ствием высокой температуры (3000-8000 °К) испаряются в плазму дуги и определяют спектр излучения плазмы.

Для определения легковозбудимых элементов используют возбуж­дение в пламени газовой горелки, а в качестве измерительного устрой­ства служит фотометр.

Разработанные специально для этих целей приборы называются пламенными фотометрами.

Рис. 6.49. Принципиальная схема пламенного фотометра.

1 — Цилиндры с топ­ливом и воздухом или кислородом; 2 - клапаны, регулирующие давление, и устройства для измерения расхода газов; 3 — распылительная камера; 4 — горелка; 5 — исследуемый раствор; 6 — устройство для осушения распылитель­ной камеры; 7 — фокусирующая линза; 8 — входная щель монохроматора (ус­тройства для разделения сложного спектра на отдельные спектральные линии), 9 — призма, разделяющая свет по длине волны; 10 — выходная щель моно­хроматора; 11 — фотодетектор; регистрирующее устройство.

Пламя особенно удобно использовать для возбуждения метал­лов, обладающих низким потенциалом ионизации (то есть щелочных металлов). Процедура ввода образца сравнительно проста — раство­ры можно вводить в пламя в виде аэрозолей. Типичное устройство прибора для эмиссионной фотометрии пламени показано на рис. 6.39.

ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ И ФЛУОРИСЦЕНЦИЯ

Излучение света молекулами — люминесценция — может происхо­дить при передаче энергии им в различных процессах:

• воздействие потоком электронов (катодными лучами) — катодолюминесценция;

• тепловой нагрев — термолюминесценция;

• химические реакции — хемилюминесценция;

• воздействие электрическим током — электролюминесценция;

• ультразвуковое воздействие — сонолюминесценция;

• воздействие механическим трением — триболюминесценция;

• облучение ионизирующей радиацией — радиолюминесценция;

• облучение ультрафиолетовым и видимым светом — фотолюминес­ценция или флуоресценция.

Таким образом, флуоресценция является частным случаем люми­несценции, когда вторичное свечение объекта вызвано возбуждени­ем световой волной. Возбуждение происходит при большей энергии, к) есть при меньшей длине волны, чем вторичное свечение. Поэтому при флуоресценции длина волны свечения больше, чем длина вол­ны возбуждения. Процесс флуоресценции можно представить выра­жением:

,

где Х и X* стационарное и возбужденное состояние молекулы, и — квант возбуждающего и вторично излученного света.

По характеру свечения различают фосфоресценцию — свечение, продолжающееся относительно долго после прекращения воздействия, и флуоресценцию — свечение, происходящее только во время воздействия.

Рис. 6.40. Молекулярная структура 2 флуорофоров и 2 люминофоров, применя­емых в клинической химии.

Явление флуоресценции (или флюоресценции) получило свое название от природного минерала — флюорита , у которого оно впервые наблюдалось. Веществами, способными к свечению — флуорофорами — являются такие биологические соединения как трип­тофан, тирозин, фенилаланин, нуклеотиды (НАДН, НАДФ-Н), флавины, порфирины, хлорофиллы, каротиноиды, некоторые ви­тамины, окисленные липиды, белки и другие. В качестве меток при проведении флуоресцентного и люминесцентного анализа часто используются флуорофоры и люминофоры, представленные на ри­с. 6.40.

Рис. 6.41. иллюстрирует явление флуоресценции.

На рис. 6.42. показаны схемы наблюдения флуоресценции. Для фотометрических исследований флуоресценции применяют специализированные фотометры — флуориметры, у которых выходная щель из кюветы смонтирована под углом к проходящему свету, согласно прин­ципу, изображенному на рис. 6.42.

Рис. 6.41. Энергетические переходы в молекулах при флуоресценции.

А — элек­тронные переходы, соответствующие поглощению света ( и ), безизлучателъным переходам на нижний возбужденный уровень и излу­чению ; Б — Спектральные кривые поглощения и флуоресценции в случае двух возбужденных уровней в молекуле. Излучение происходит с одного Е уровня.

Рис. 6.42. Схемы наблюдения флуоресценции.

1 — ртутная лампа; 2 — свето­фильтр; 3 — кювета с раствором исследуемого вещества; 4 — приемник излу­чения, а — приемник принимает только флуоресцентное излучение. Такое расположение используется во многих фотометрах, б — такая схема применяется только для сильно флуоресцирующих растворов.

Часто флуориметры объединены в один прибор с фотометрами, так как блок облучения кюветы и сис­тема электронной регистрации у них одинаковые.

В люминометрах характерной особенностью является отсутствие источника света, свечение образца индуцируется химической реакци­ей (хемилюминометры) или любым другим способом передачи энер­гии веществу.

В клинической химии достаточно часто встает вопрос о выборе технологии для определения той или иной группы аналитов. Напри­мер, определение гормонов можно проводить методами фотометрирования, в том числе турбидиметрией и нефелометрией или ИФА-анализом, можно воспользоваться технологиями, основанными на ис­пользовании флюоресцентной или люминесцентной метки. Основным недостатком фотометрических методов является относительно узкий линейный диапазон измерения результатов. Даже лучшие фотометры позволяют регистрировать изменения аналитов (гормонов) не более чем в пределах 4 десятичных порядков. Флюоресцентные и люминес­центные технологии увеличивают линейный диапазон до 6—8 десятич­ных порядков, то есть позволяют работать без разведения. В таблице 6.6 представлены сравнительные данные о чувствительности фотометри­ческих, флуоресцентных и люминесцентных методов определения гор­монов (и других аналитов). Флуоресцентные и люминесцентные тех­нологии позволяют существенно увеличить чувствительность определения веществ в биопробах, однако они используются, как правило, в закрытых технологиях, включающих прибор-реактивы-калибраторы-контрольные материалы и т. д.

Лекция №7