Лизоцимная активность

Лизоцим –термостабильный белок, фермент, разрушает клеточную стенку преимущественно грамположительных бактерий, разрывая β-гликозидные связи между аминосахарами пептидогликана, что способствует образованию протопластов с последующим их лизисом. Содержится во всех тканевых жидкостях, в лейкоцитах, макрофагах и других фагоцитирующих клетках.

Продуцируется лизоцим преимущественно клетками моноцитарно/макрофагального ряда. Лизоцим усиливает антибактериальную активность комплекса антиген (микроорганизм) – антитело - комплемент, способствуя лизису пептидогликана клеточной стенки бактерий. Помимо животного раличают растительный и микробный лизоцим.

Микробный лизоцимявляется одним из факторов колонизации. Лизоцимная активность (ЛА) определяется путем посева исследуемой культуры микроорганизма на питательную среду, содержащую 1 млрд. суспензию суточной агаровой культуры Micrococcus luteus (lysodeikticus) АТСС 15307 (ГИСК им. Тарасевича). Результат оценивается после инкубации при 37⁰С в течение суток по зоне лизиса в толще среды индикаторного штамма микрококка вокруг изучаемых колоний.

Иммуноферментный метод

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях.

В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой: [AT]+[АГ]↔[АТАГ].

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

Принципальная схема иммуноферментного анализа для выявления АТ является следующей.

1) Известный АГ (вирус, белок) – диагностикум фиксируется на твердой фазе.

2) К нему добавляют сыворотку обследуемого с неизвестными АТ. После инкубации и промывки на антигене остаются специфичные к нему АТ, если таковые имелись в сыворотке обследуемого.

3) Для обнаружения комплекса АГ-АТ, к нему добавляют кроличью антиглобулиновую сыворотку меченую ферментом (АГС-Ф). Для получения данной сыворотки кролика иммунизируют иммуноглобулинами человека. Полученную от кролика сыворотку метят каким-либо ферментом, например, пероксидазой хрена. Если в обследуемой сыворотке есть АТ к АГ (диагностикум), то они будут служить антигеном для антиглобулиновой сыворотки.

4) После второй промывки образовавшийся комплекс АГ+АТ+АГС-Ф можно обнаружить, добавив субстрат на фермент (перекись водорода) и индикатор на продукты расщепления субстрата (хромоген на активные формы кислорода).

5) Изменение цвета индикатора свидетельствует о наличии искомых АТ в сыворотке обследуемого.

Среда Китта-Тароцци

Питательный бульон с глюкозой и кусочками свежих органов животных. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Сверху среду заливают слоем стерильного масла, которые не пропускает кислород из воздуха в среду. В результате создаются условия для культивирования анаэробных микроорганизмов.

Среда контроля стерильности (СКС)

Эту среду предложил Бревер (Brewer) в 1940 году для быстрого культивирования аэробов, а также анаэробов (ввиду добавления редуцирующего вещества и небольшого количества агар-агара). Рекомендуется среда для тестов на стерильность антибиотиков, биоматериала, пищевых продуктов, а также для определения фенолового коэффициента и спороцидных свойств дезинфектантов.

Среда тиогликолевая предназначена для контроля стерильности лекарственных препаратов. Состав: глюкоза, панкреатический гидролизат казеина, натрия хлорид, агар микробиологический, дрожжевой экстракт, L-цистин, тиогликолевая кислота (редуцент О₂), вода дистиллированная. Глюкоза, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и L-цистин дают питательные вещества для размножения бактерий. Тиогликолят натрия снижает окислительно-восстановительный потенциал, а также нейтрализует бактериостатический эффект соединений ртути и других тяжелых металлов, находящихся в исследуемом материале. Любое повышение концентрации кислорода сопровождается изменением цвета специального индикатора редокс-потенциала (резазурина) на красный. Низкий редокс-потенциал помогает поддерживать небольшое количество агара в среде.