Регуляторная часть гена

Промоторы

Каждый ген состоит изрегуляторной части, с которой начинается транскрипция структурной части, где записана информация о структуре белка, и терминирующей части, где завершается транскрипция.

Промотор - это последовательность нуклеотидов, «узнаваемая» РНК-полимеразой, с которой начинается процесс транскрипции.

У прокариот процесс транскрипции осуществляется с помощью голэнзима (или «полного энзима») РНК-полимеразы, состоящего из собственноРНК-полимеразы и присоединяющегося к ней σ-фактора. Собственно РНК-полимераза состоит из 4 полипептидов: двух a, а также β и β'-субъединиц. РНК-полимераза осуществляет основную реакцию – синтез молекулы иРНК, σ-фактор необходим для опознавания промотора — особого участка в начале гена.

Выявлены общие для всех бактерий особенности структуры промоторов:

1) наличие стартовой точки транскрипции;

2) особая последовательность нуклеотидов, начиная с положения -10;

3) особая последовательность нуклеотидов в районе -35;

4) фиксированное расстояние между участками -10 и -35.

Рассмотрим их подробнее (рис. 7.35).

1. В стартовой точке транскрипции (у >90% промоторов) располагается пурин. Довольно часто это – центральный нуклеотид в последовательности CAT.

2. Шесть нуклеотидов ТАТААТв районеот-10 п.н. обнаруживают почти во всех промоторах. Они были найдены впервые в 1975 г. Д. Прибновым и названы доменом Прибнова.

3. Последовательность TTGACAнаходится в районе-35 п.н.

4. Расстояние, разделяющее указанные консервативные последовательности, составляет 16и18 п.н.в 90 % промоторов. В виде исключений может быть 15, 19 или 20. Это расстояние важно, поскольку согласуется с формой молекулы РНК-полимеразы.

Рассмотрим процесс инициации транскрипции. Вначале РНК-полимераза контактирует с районом от -55 до +20 пн. Инициирующий комплекс содержит РНК-полимеразу и σ-фактор, который слабо связывается с участком промотора в положении -35 п.н., контролируя посадку РНК-полимеразы именно на промотор.

Затем РНК-полимераза связывается с доменом Прибнова — районом вблизи положения -10. Одновременно с этим расплетаются полностью почти два витка двойной спирали ДНК (длиной в 17 п.н.) вокруг нуклеотида в положении -10. Следует отметить, что в этом положении присутствуют в основном А-Т нуклеотиды, имеющие по две водородные связи между собой, что значительно облегчает возможность их разъединения.

Далее σ-фактор удаляется, а собственно фермент РНК-полимераза становится более компактным, превращаясь вкомплекс элонгации.

У эукариот процесс транскрипции значительно сложнеепо двум причинам.

Во-первых, транскрипция осуществляется под действием трех разных РНК-полимераз:

РНК-полимераза I синтезирует 18, 28 и 5,8S рРНК.

РНК-полимераза II считывает мРНК с генов, кодирующих белки и некоторые мяРНК (малые ядерные РНК);

РНК-полимераза III транскрибирует гены 5S рРНК, тРНК и остальные мяРНК.

Во-вторых, РНК-полимераза эукариот не может самостоятельно инициировать транскрипцию. Для ее активирования необходимо большое число белков, называемых факторами транскрипции,которые должны объединиться в комплекс, прежде чем транскрипция начнется.

Рассмотрим организацию регуляторных участков гена, транскрибируемого с помощью РНК-полимеразы II. Типичный ген, считываемый этим ферментом, имеет промотор, расположенный выше стартовой точки транскрипции. Он содержит несколько коротких (меньше 10 п.н.) последовательностей нуклеотидов, с которыми связываются белки – общие факторы транскрипции. Эти последовательности разбросаны на участке длиной свыше 200 пн. Они могут быть позитивнымии негативными.

Другой регуляторный участок – энхансер – находится в нескольких тпн от промотора и содержит более плотно расположенные регуляторные элементы – последовательности нуклеотидов, которые также связывают факторы транскрипции, но они называются специфическими.

Промотор состоит из нескольких элементов. Из них самым близким к точке начала транскрипции является ТАТА-домен, называемый также доменом Хогнесса. Затем следуют домены СААТ и GC.

Домен СААТконтролируетпервоначальное связывание РНК-полимеразы с промотором, ТАТА и GC, по-видимому, выполняют вспомогательные роли.

Помимо РНК-полимеразы в процессе транскрипции участвуют уже упомянутые белки - общие факторы транскрипции. Они связываются с РНК-полимеразой II, формируя комплекс, окружающий стартовую точку.

Известно шесть общих факторов транскрипции: TFIIA, TFIIB, TFIID, ТFIIE, TFIIF и TFIIH (по некоторым данным, семь — описан TFIIJ). Они обозначаются первыми буквами слов transcription factors — TF с добавлением римской цифры I, II или III, в зависимости от того, какая это РНК-полимераза — I, II или III. Далее следует обозначение собственно белковой молекулы.

В состав транскрибирующего комплекса входят еще белки, называемые SrbиSwi/Snf,которые помогают РНК-полимеразе разрушить нуклеосомы и декомпактизовать молекулу ДНК.

Всего в состав транскрибирующих комплексов входит до 50 белков, иногда эти комплексы называют транскриптосомами, илитранскрипционными пузырьками.

Комплекс РНК-полимеразы II и общих факторов транскрипции может функционировать самостоятельно, но с низкой эффективностью. Чтобы достичь необходимого уровня, требуется участие специфических факторов транскpипции.

Они обладают двумя важнейшими свойствами:

1) опознавать специфические последовательности нуклеотидов, расположенные в энхансерах, промоторах и других регуляторных элементах данного гена;

2) связываться с белками-другими компонентами транскрипционного аппарата после присоединения к ДНК.

Известны различные белки, имеющие следующие специфические мотивы связывания с ДНК:

1. Белки-рецепторы стероидных гормонов. Каждый такой белок активируется в результате связывания с определенным стероидным гормоном, т.е. в некоторых случаях для транскрипции гена нужны еще и гормоны.

2. Мотив «цинковые пальцы» (zinc-finger).

3. Спираль-поворот-спираль. Одна L-спираль лежит в широкой бороздке ДНК, вторая под углом поперек ДНК.

4. Спираль-петля-спираль.

5. «Лейциновая застежка» - состоит из последовательности аминокислот с остатком лейцина в каждой седьмой позиции. Мотивы двух белков взаимодействуют, образуя димер.

Энхансеры

Чтобы транскрипция какого – либо гена пошла, нужен промотор, а чтобы она происходила интенсивно, необходимы энхансеры.

В 1981 г. Дж. Банерджи, С. Раскони и С. Шеффнер обнаружили некую последовательность нуклеотидов у вируса SV40, которая в сотни раз усиливала транскрипцию гена β-глобина, если связывалась с ним. Авторы назвали подобные последовательности энхансерами (усилителями).

Энхансеры отличаются от промоторов в трех отношениях:

-во-первых, расстояние, на которое они удалены от точки инициации транскрипции, не является фиксированным;

- во-вторых, это расстояние очень большое;

- в-третьих, многие энхансеры могут располагаться не только в 5'-, но и в 3'-области, и в середине гена.

С энхансерами специфически связываются регуляторные белки(специфические факторы транскрипции), активирующие процесс транскрипции.

Как эти белки могут действовать на больших расстояниях?

Согласно самой простой модели, ДНК между энхансером и промотором образует петлю, в результате чего белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с одним из общих факторов транскрипции или с молекулой самой РНК-полимеразы.

Разнообразиеобщих факторов транскрипции невелико, но каждый из них представлен в клетке большим количеством копий, поскольку связывается с промоторами всех генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II. Кроме этого в клетке существуют тысячи различных специфических факторов транскрипции, связывающихся с регуляторными участками ДНК. Их наборы различаются в разных клетках и у разных генов. Каждый из этих белков представлен малым числоммолекул и распознает свою особую последовательность нуклеотидов в регуляторных участках. С помощью этих белков-регуляторов каждый ген специфически включается или выключается, т. е. для генов, характерных для каждого органа или ткани, есть свой белок-регулятор и свой энхансер.

У дрожжей имеются последовательности, по своему действию похожие на энхансеры, которые называются UAS (upstream activating sequences). Как и энхансеры, они могут функционировать в любой ориентации и на различных расстояниях от промотора. Однако, в отличие от энхансеров, UAS не могут работать, когда локализованы ниже промотора. UAS-последовательности активируются, когда с ними связываются белки GAL4.

Недавно был разработан методнаправленной экспрессии генов у дрозофилы с использованием энхансеров. Суть его заключается в том, что исследователи создают две трансформированные линии мух. Для создания первой линии в Р-элемент наряду с обычными маркерами вводится ген, кодирующий белок GAL4.

Такой транспозон встраивается в случайные районы хромосом дрозофилы, в том числе может попасть под какой-нибудь энхансер, например, под энхансер гена, работающего в клетках формирующегося крыла или ноги. Поэтому GAL4будет экспрессироваться в клетках крыла или ноги, однако никаких последствий для этих клеток не будет, поскольку белок GAL4 может активировать транскрипцию другого гена лишь в том случае, если он свяжется с промотором UAS, который в норме присутствует только в геноме дрожжей.

Поэтому создают вторую линиюдрозофилы, которую трансформируют транспозоном, содержащим испытуемый ген X, сшитый с промотором UAS. Когда в результате скрещивания двух линий оба транспозона объединяются в геноме потомка, ген GAL4начинает функционировать в тех клетках, в которых активен его энхансер. Белок GAL4 связывается с промотором UAS, который и «включает» ген X. При этом индукция Xбудет наблюдаться совсем не в той ткани, в которой он активируется своим собственным энхансером, а в той, где функционирует энхансер гена GAL4. Такая экспрессия называется эктопической, т. е. «не на своем месте».

Интересный пример использования этого методического подхода связан с работами Вальтера Геринга (р. 1939) по изучению генетики развития глазу дрозофилы и некоторых других животных. Мутации некоторых генов, например eyeless у дрозофилы, приводят к полному отсутствию глаз. В результате сопоставления молекулярной организации генов Aniridia у человека, Small eye у мыши и eyeless у дрозофилы было найдено значительное их сходство. Это тем более удивительно, что анатомически глаза у мухи и млекопитающих очень мало напоминают друг друга.

В 1995-1996 гг.В. Геринг с сотрудниками получили гетерозиготных мух при скрещивании двух линий с мутацией eyeless, содержащих транспозоны с GAL4и UAS. GAL4находился под контролем энхансера, функционирующего в клетках развивающихся ног, крыльев и органов головного комплекса. В транспозон, содержащий UAS, на место гена Xбыла встроена ДНК нормального аллеля гена eyeless. В результате функционирования гена eyeless появились, во-первых, нормальные глаза, а также маленькие глаза в разных участках крыльев, ног, на голове — там, где был активен энхансер.

Затем был поставлен еще более смелый эксперимент: на место гена Xв транспозон с UAS встроили ДНК гена Small eye,выделенную из генома мыши. И опять начали формироваться сложные глаза, характерные для дрозофилы, в разных участках тела мухи . Как же могло получиться, что действие гена, контролирующего развитие глаза у мыши, привело к развитию глаза совершенно другого типа у дрозофилы?

Оказалось, что в процессах формирования глаз у животных принимает участие около 2,5 тыс. генов, которые организованы в каскад. При этом все три рассмотренных выше гена - Small еye, Aniridia и eyeless – кодируют лишь факторы транскрипции; они находятся в начале каскада, т. е. только дают команду нa начало развития глаза, а остальные гены, функционирующие после них, уже определяют, какой глаз будет сформирован.

Инсуляторы

Теоретически можно предположить, что любой конкретный промотор может находиться под контролем неограниченного числа энхансеров, разбросанных по всему геному. Однако этого не происходит, поскольку в геноме существуют особые структуры, называемые инсуляторами (от англ. insulate — изолировать, отделять от окружения). Инсуляторы – участки ДНК, которые разграничивают соседние гены, блокируют взаимодействия между энхансерами и чужими промоторами . Инсуляторы замыкают ген с двух сторон.

С инсуляторами связываются специфические белки, которые и являются, вероятно, структурным препятствием для взаимодействия "чужих" энхансеров со "своим" промотором.