Оптический микроскоп.

Каково различие между оптическим телескопом и микроскопом? В телескопе реальное изображение, созданное объективом (с большим фокусным расстоянием), формируется в задней фокальной плоскости. Окуляр телескопа размещают так, чтобы это изображение оказалось в его передней фокальной плоскости, как показано на рис. 12. В отличие от телескопа, объектив микроскопа имеет очень короткое фокусное расстояние. Рассматриваемый объект помещают очень близко к фокусу объектива, чтобы расстояние до изображения было намного больше фокусного расстояния. Промежуточное изображение объекта является реальным и увеличенным. Его рассматривают через окуляр, который повторно увеличивает изображение, как показано на рис. 13.

Есть соблазн увеличивать изображение объекта до бесконечности, добавляя дополнительные линзы. Однако французский учёный Аббе показал, что из-за волнового характера света невозможно различить особенности, расстояние между которыми меньше длины волны. Поэтому использование слишком большого количества линз ведёт к бесполезному увеличению.

Телескопы имеют большой диаметр, поскольку они должны собирать достаточное количество света от удалённых неярких звёзд. Микроскоп же должен иметь максимальное разрешение. В оптическом микроскопе яркость изображения достигается за счёт использования интенсивного источника света. Отражённый (или прошедший) свет собирают при помощи объектива с большим значением числовой апертуры, характеризующей долю собираемого света.

Объектив микроскопа фокусируют на образец, полученное промежуточное изображение рассматривают в окуляр и получают увеличенное реальное изображение (рис. 13). Поскольку яркость изображения обратно пропорциональна квадрату числовой апертуры, она обратно пропорциональна квадрату увеличения. Отметим, что во флуоресцентном микроскопе отражённого света яркость обратно пропорциональна четвёртой степени числовой апертуры.

Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива и увеличение окуляра:

, (8)

где L – длина тубуса микроскопа (равная расстоянию между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра), l_n – расстояние наилучшего видения, f₀ и f_e – фокусные расстояния объектива и окуляра соответственно.

Если между линзой и образцом находится воздух, максимальное значение величины nsina равно единице, но на практике числовая апертура редко превышает 0,85 (в последнем поколении микроскопов современные технологии позволяют получать числовую апертуру сухого объектива, равную 0,95). В микроскопии часто используют иммерсионные объективы, погружаемые в жидкость (рис. 14). Иммерсионной жидкостью могут служить масло (n = 1,52), глицерин (n = 1,47), дистиллированная вода (n = 1,33) и т.п. Поскольку показатель преломления масла или другой иммерсионной жидкости (и покровного стекла) выше, чем у воздуха, это позволяет увеличить максимальный угол, под которым лучи от точечного источника попадают в объектив. Следовательно, при использовании иммерсии значение апертуры выше, чем в случае воздуха. Максимальные значения апертуры иммерсионных объективов достигают 1,3-1,4 в зависимости от типа иммерсионной жидкости. Объективы микроскопов проходящего света в основном предназначены для работы с покровным стеклом, а объективы микроскопов отражённого света работают без них, и это нужно учитывать при работе.

Яркость изображения определяется количеством попадающего в объектив света, которое пропорционально величине апертуры. Если объектив сфокусирован на определённую плоскость, то особенности объекта, находящиеся в пространстве немного выше и ниже этой плоскости, оказываются не в фокусе. Диапазон расстояния, на котором особенности объекта выглядят достаточно резко, называют глубиной резкости. Таким образом, плоскость объекта можно считать тонким слоем, в котором все точки находятся в фокусе. Глубина резкости h выражается формулой:

, (9)

где n – показатель преломления изучаемого материала.

Глубина резкости различных объективов для длины волны 550 нм приведена в табл. 2.

Таблица 2

Глубина резкости различных объективов

Поле зрения, то есть та часть поверхности образца, которая видна в микроскопе, зависит как от объектива, так и от окуляра. Размер изображения может быть ограничен внутренним диаметром тубуса микроскопа (стандартный размер которого равен 23,2 мм), но на практике он обычно ограничивается диаметром окуляра (18 мм). Таким образом, при десятикратном (10´) увеличении микроскопа диаметр поля зрения равен 1,8 мм. Если увеличение микроскопа равно 40´, диаметр поля зрения равен 0,45 мм.

Один из наиболее важных вопросов состоит в том, при каком увеличении микроскопист может увидеть все детали объекта? Ответ на него зависит от разрешающей способности глаза. Невооружённый глаз может различить две точки, если угол между ними не меньше одной минуты. Таким образом, на расстоянии наилучшего видения разрешающая способность глаза равна 100 мкм. Чтобы избежать излишнего напряжения глаза, расстояние между двумя точками должно быть в два-три раза больше. Минимальное увеличение, необходимое для разрешения двух точек, равно отношению разрешающей способности глаза (скажем 300 мкм) к расстоянию между этими точками. Расстояние между двумя точками ограничено длиной волны, и это означает, что оптимальное увеличение находится в интервале от 500´ до 1000´. Если используется большее увеличение, снижается количество разрешаемых деталей, а качество изображения ухудшается, поскольку становится заметной дифракционная размытость. Избыточное увеличение называется бесполезным.

Аберрация.

До сих пор обсуждались идеальные тонкие линзы. В реальных линзах наблюдаются эффекты, снижающие качество изображения. Серьёзным недостатком первых линз была хроматическая аберрация, состоящая в фокусировании волн различной длины (цвета) в различные точки на оптической оси (рис. 15, а). Причиной этого явления является дисперсия, то есть зависимость показателя преломления стекла n от длины волны l. Для борьбы с хроматической аберрацией использовали комбинацию стёкол марок крон и флинт и сделали двойную ахроматическую линзу, изображённую на рис. 15, b. Это снизило хроматическую аберрацию, но не устранило сферической аберрации, состоящей в несовпадении фокусов для лучей, находящихся на различном расстоянии от оси линзы, как показано на рис. 16. Этот эффект можно компенсировать изменением профиля линзы, но обычно для этого используют составные линзы (впервые в 1830 г. Джозеф Листер для устранения этого эффекта использовал комбинацию двух ахроматических линз, расположенных на некотором расстоянии друг от друга).

Для микроскопа большое значение имеет качество осветительной системы, включающей конденсор. Осветительная система должна удовлетворять трём требованиям:

1. Обеспечивать максимальное разрешение и контраст изображения.

2. Просто регулироваться.

3. Поле зрения должно быть равномерно освещено.

Этим требованиям отвечают две схемы осветительной системы. Схема первой приведена на рис. 17. Она состоит из крупного источника света и конденсорной линзы, создающей изображение источника в плоскости объекта. Числовая апертура конденсора должна быть не меньше, чем у объектива. Вторую систему называют системой Келера (рис. 18). Она состоит из небольшого, но мощного источника света, помещённого в фокус линзы, и конденсора, как и предыдущая система.

Образец можно рассматривать как через тонкое покровное стекло, так и без него. Мягкий образец (например, биологический) с неровной поверхностью можно зажать между двумя покровными стёклами. В этом случае естественно использовать иммерсионный объектив с большим увеличением. Если на объективе написано «NCG» или «NC», он предназначен для работы без покровного стекла. Обратим внимание, что объективы микроскопов отражающего света предполагают работу без покровного стекла.

Самым важным элементом микроскопа является объектив. Он может быть предназначен для работы на воздухе или быть иммерсионным, когда между ним и объектом помещается жидкость типа масла или воды. В этом случае на корпусе объектива написано «МИ», «oel» и нанесено чёрное кольцо. Аналогично, надпись «WI» означает, что объектив предназначен для работы в воде. Водоиммерсионные объективы достаточно дорогие и используются в основном в биологии, медицине и микроэлектронике.

На некоторых объективах имеется надпись «UV». Она указывает, что объектив сделан из специального стекла и работает в ультрафиолетовой области спектра (длина волны менее 400 нм). Подобные объективы могут работать в специальных микроскопах для микроэлектроники и в ультрафиолетовых микроскопах.

При выборе объектива нужно учитывать его рабочее расстояние. Рабочее расстояние объектива – это расстояние от его передней плоскости до покровного стекла (или поверхности образца, если стекло не используется) при условии, что образец находится в фокусе. Описание объективов и их рабочих расстояний приведено в табл. 3.

Таблица 3

Рабочее расстояние различных объективов

Обычно в микроскопе имеется окуляр. На окуляре, как правило, написано его увеличение и цифры 20 (18), 22 (21, 23) или 26,5 (25). Эти цифры называются «линейное поле» окуляра. Линейное поле окуляра – это размер полевой диафрагмы, расположенной внутри окуляра в плоскости изображения и ограничивающей видимое поле на предмете. Окулярное число – это произведение линейного поля окуляра на его увеличение. Диаметр поля зрения (в мм) рассчитывается делением линейного поля окуляра на увеличение объектива. Следовательно, если увеличение объектива 10´, а окуляр имеет линейное поле 22, то диаметр поля зрения равен 2,2 мм.

На окуляре могут иметься надписи C, K, PL, WF или H. Если объектив не имеет коррекции поперечной хроматической аберрации, нужно использовать окуляр, компенсирующий этот недостаток объектива. Буквы C и K означают, что окуляр является компенсационным. Надпись WF указывает, что окуляр широкоугольный (поле зрения более 60°). Буква H свидетельствует, что глаз не обязательно прижимать к окуляру (обычно расстояние от таких окуляров до глаза соответствует 15-18 мм). Это удобно для людей, носящих очки. Фотоокуляр (PL) – это окуляр с малым увеличением, проектирующий созданное объективом изображение на плоскость фотоплёнки.