ЭПР-спектроскопия в исследовании биологических мембран

Метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) основан на взаимодействии

вещества с магнитным полем. Как следует из названия метода, он применяется для

исследования парамагнитных частиц.

Известно, что при помещении парамагнетиков в магнитное поле, парамагнетик

втягивается в это поле. Это связано с наличием у парамагнетиков магнитных моментов.

Магнитные моменты создаются неспаренными электронами.

Примерами парамагнитных частиц, представляющих интерес для биологов, служат

свободные радикалы, являющиеся промежуточными продуктами биохимических реакций,

ионы металлов переменной валентности, таких как железо, медь, марганец и др.

Проявление магнитного момента у электрона связано с тем, что электрон является

заряженной частицей, и при вращении электрона вокруг своей оси (спиновое движение)

возникает магнитное поле, направленное вдоль оси вращения. При помещении парамагнитного образца в магнитное поле магнитные моменты неспаренных электронов ориентируются в этом поле, подобно тому, как это происходит с магнитными стрелками.

Магнитный момент неспаренного электрона во внешнем магнитном поле может

ориентироваться двумя способами - по полю и против поля. Таким образом, если в

исследуемой системе имеются неспаренные электроны, наложение внешнего магнитного поля

приводит к разделению электронов по группам: магнитные моменты одних электронов

ориентированы по полю, других – против.

Каждой из ориентаций магнитных моментов электронов соответствует свободная энергия.

Разница в энергии электронов определяется выражением

ΔE1 = Е2 - Е1 = g⋅β⋅H

где: β - константа, называемая магнетоном Бора и равная 9.27.10-21 эрг/Гс, а g - константа,

называемая g - фактором и равная 2, когда магнитный момент электрона является спиновым

магнитным моментом, H - напряженность магнитного поля.

Величина ΔЕ может быть выражена и другим способом, а именно ΔЕ⋅=⋅hν, где hν -

величина кванта энергии, необходимого для перевода электрона из одного состояния в другое.

Объединяя оба выражения для ΔЕ, можно записать:

hν = g⋅β⋅H

Это выражение носит название условия резонанса.

Если к находящейся в магнитном поле системе, содержащей неспаренные электроны, подвести высокочастотное излучение с частотой ν, определяемой условием условием резонанса, то в исследуемой системе возникнут вынужденные электронные переходы между соседними уровнями Е1 и Е2. Переходы с одинаковой вероятностью будут происходить как из состояния Е1 в состояние Е2, так и наоборот. Однако, число переходов снизу вверх больше числа переходов сверху вниз, поскольку в соответствии с законом Больцмана заселенность нижнего уровня выше. Переходы из верхнего состояния в нижнее происходят с испусканием энергии, а переходы из нижнего в верхнее - с поглощением. Но поскольку число переходов снизу вверх больше, то в целом при выполнении условия резонанса в образце будет наблюдаться поглощение высокочастотного излучения. Частота, при которой наблюдается резонансное поглощение высокочастотного излучения образцом, связана с напряженностью магнитного поля:

νβ=gH/h

Из этого выражения видно, что резонансное поглощение можно наблюдать:

а) при изменении частоты ν электромагнитного излучения при постоянстве H

б) при изменении H при постоянстве ν.

Из технических соображений применяется второй способ регистрации.

В спектрометрах ЭПР сигнал регистрируется не в интегральном виде (рис.2.), а в виде

первой производной.

Регистрация сигнала ЭПР в виде первой производной оказывается предпочтительной в

связи с тем, что при таком способе регистрации удается поднять чувствительность

спектрометра на несколько порядков по сравнению с регистрацией сигнала в интегральном

виде.

Для характеристики сигналов ЭПР употребляется набор параметров. Одним из таких

параметров является амплитуда сигнала I (рис.3б), которая характеризует интенсивность

сигнала. Величина I измеряется в подавляющем большинстве случаев в относительныхединицах (например в мм). Ясно, что чем больше концентрация парамагнитных частиц в образце, тем больше будет величина (при неизменности ширины сигнала). Величиной, характеризующей ширину сигнала, служит ΔHmax - ширина линии между точками максимального наклона (рис.3б.). Эта величина измеряется в единицах магнитного поля - гауссах (Гс) или миллитеслах (мТл). Для того, чтобы измерить ΔHmax в единицах магнитного поля, необходимо знать масштаб по оси абсцисс на ленте самописца (т.е. знать сколько гаусс приходится, например, на 1 см на ленте самописца). Для измерения ΔHmax применяются специальные эталоны.

Сигнал ЭПР обладает не узкой линией, а полосой поглощения с определенной шириной. Это значит, что уровни спинового взаимодействия несколько размыты. В первую очередь это объясняется взаимодействием не только с тем магнитным полем, которое создается прибором, но и с другими: спин-спиновые взаимодействия создают дополнительные локальные магнитные поля в местах расположения соседних спинов, меняя таким образом строгое условие резонанса (уширяя линию поглощения). Этим процессам соответствует время Т. Оно тем больше, чем меньше спин-спиновые взаимодействия. Ширина линии поглощения зависит от Т следующим образом:

ΔH=1/Т

Если вязкость в образце мала, то за счет быстрых молекулярных движений взаимные влияния успевают усредниться при поглощении переменного поля. В этом случае резонанс наблюдается при усредненной линии с уменьшенной шириной. Если же вязкость повышается (например, при замораживании), то скорость молекулярного движения замедляется, и спины успевают почувствовать влияние разных локальных полей. Время Т сохранения спинового состояния уменьшится, а ширина линии – увеличится. Таким образом по ширине линии можно судить о характере внутримолекулярных движений в микроокружении спиновой частицы. В методе ЭПР обычно применяются нитроксильные радикалы.

При записи спектра ЭПР этого радикала наблюдается три пика (поскольку электрон взаимодействует с ядром азота, которое может ориентироваться в магнитном поле тремя способами: по полю, против поля и перпендикулярно полю):

При взаимодействии радикала с окружающими частицами и уменьшению его подвижности сигнал ЭПР расплывается:

Чем больше ширина, тем сильнее ограничена подвижность радикала. Таким образом, сравнивая подвижности свободных радикалов и радикалов, находящихся в мембране, была определена вязкость последней. Она оказалась сходной с вязкостью подсолнечного масла. Из этого был сделан важный вывод о том, что мембрана – динамичная структура, в ней возможно процессы латеральной диффузии молекул.