Особенности работы с микроскопом при биологических исследованиях. Методика приготовления временных препаратов.

Обычно световой поток от источника света при отсутствии препарата образует в поле зрения микроскопа равномерный фон - «невозмущенный свет». При установлении препарата неоднородные частицы объекта, отличающиеся друг от друга и от окружающей среды по поглощению света и показателю преломления, образуют рассеянный свет, который и создает изображение. Изображение объекта в микроскопе увеличенное, обратное, мнимое. При микроскопировании объекты исследования подразделяют на: прозрачные и непрозрачные, амплитудные и фазовые, изотропные и анизотропные. Для разных объектов, обладающих неодинаковой способностью рассеивать свет, применяют свои, характерные методы наблюдения. Метод светлого поля в проходящем свете наиболее распространенный и доступный для наблюдения. Метод светлого поля в проходящем свете используется для изучения прозрачных объектов. К прозрачным объектам относятся срезы и отдельные клетки растений, животные ткани и др. В цитологии, эмбриологии, анатомии и цитохимии метод светлого поля в проходящем свете широко применяется для изучения окрашенных препаратов. Для изучения непрозрачных биологических объектов можно применить метод светлого поля в отраженном (косом) свете. Косое освещение достигается путем смещения апертурной диафрагмы в направлении, перпендикулярном к оптической оси, для этого используется конденсор ОИ-14. Метод темного поля разработан австрийским ученым

Р. Зигмонди и используется для получения изображения прозрачных объектов, плохо видимых при наблюдении в светлом поле, например, живых клеток. В данном методе используется темнопольный конденсор ОИ-13, освещающий объект сбоку. При наблюдении объектов методом темного поля невозмущенные лучи осветителя не попадают в объектив и изображение создается только рассеянными лучами, идущими от объекта. В объектив попадает свет, отраженный от объекта и создается возможность увидеть на темном поле светящиеся ультрамикроскопические частицы, размер которых меньше предельной разрешающей способности объектива. В темном поле можно вести наблюдения за изменением степени дисперсности коллоидов протопласта, наблюдать явление коагуляции, погибающие и нормальные клетки, т.к. протопласт погибающих клеток светится ярко, а нормальных слабо. В темном поле можно наблюдать митохондрии, бактерии. Метод фазового контраста и интерференционная микроскопия применяется для наблюдения прозрачных объектов. В живых клетках, применяя этот метод, можно увидеть процесс митоза, хромосомы, митохондрии, включения, изучать действие на них физических и химических объектов и фиксаторов. Объективы для фазового контраста имеют фазовую пластинку в виде кольца. Апертурная диафрагма на конденсоре тоже кольцевая. Для проведения исследований необходимо к микроскопу иметь фазово-контрастное устройство КФ-4, КФ-5. К методу фазового контраста близок принцип действия интерференционного микроскопа.

Метод наблюдения в поляризованном свете используется для изучения объектов, обладающих двойным лучепреломлением. Метод применяется для изучения структуры митотического веретена, фибриллярных белков, крахмала, кристаллов. Для этого используются специальные устройства: поляризатор и анализатор. Работая этим методом используют красители метиленовый синий, акридиловый оранжевый, риванол и др. Метод флуоресцентной и ультрафиолетовой микроскопии основан на том, что препарат рассматривается в свете, излучаемом самим препаратом, так как ряд соединений в клетке при освещении коротковолновыми лучами фиолетовыми, ультрафиолетовыми и др. лучами способны светиться (флуоресцировать) под микроскопом желто-зеленым или оранжевым светом на темном фоне. Собственная флуоресценция происходит потому, что молекулы объекта после поглощения света.