Уровни структурной организации хроматина

Молекулы ДНК имеют диаметр 2 нм, но их длина в хромосомах может достигать нескольких сантиметров. Очевидно, что упаковка таких длинных молекул в объеме клеточного ядра, имеющего диаметр всего 5-8 мкм, должна быть в высшей степени регулярной. Проблема укладки молекул ДНК в ограниченном объеме ядра осложняется еще и тем, что одновременно необходимо обеспечить возможность локальной распаковки ДНК и доступа к ней ферментов репликации и транскрипции. Вот почему хроматин в клеточном ядре образует сложные пространственные структуры с несколькими уровнями организации.

Первый уровень укладки ДНК в хроматине обеспечивается нуклеосомами. Они представляют собой округлые частицы диаметром 15 нм, которые связаны между собой участками ДНК длиной около 20 нм. Отдельная нуклеосома состоит их белковой сердцевины, на которую накручена молекула ДНК.

Белковая сердцевина нуклеосомы, или кор, имеет форму диска диаметром 11 нм и толщиной 6 нм. Она содержит по две молекулы гистонов H2A, H2B, H3 и H4. Если развернуть сердцевину, то можно обнаружить, что молекулы гистонов соединены в последовательности H2A, H2B, H4, H3, H3, H4, H2B, H2A. При сворачивании сердцевины молекулы гистонов располагаются как бы в два этажа, наподобие винтовой лестницы.

Молекула ДНК в виде левозакрученной суперспирали совершает 1,75 оборота вокруг сердцевины. При этом в непосредственный контакт с гистонами вступает 146 пар нуклеотидов. Длина линкерной ДНК, соединяющей соседние нуклеосомы, колеблется в пределах 40-70 пар нуклеотидов в зависимости от типа клетки. Таким образом, на одну нуклеосому приходится в среднем около 200 пар нуклеотидов ДНК.

Нуклеосомы укорачивают молекулу ДНК примерно в 7 раз. Они обнаружены во всех эукариотических клетках и даже у ДНК-содержащих вирусов. Однако это не означает, что вся ДНК клеточного ядра связана с нуклеосомами, и некодирующие повторы могут иметь другую укладку.

Второй уровень укладки ДНК обеспечивается взаимодействием линкерной ДНК с гистоном H1. Молекула гистона H1 своим глобулярным доменом связывается с двумя витками ДНК на нуклеосоме. Одновременно C-концевой фибриллярный домен гистона H1 вступает в контакт с линкерной ДНК. В результате соседние нуклеосомы приближаются друг к другу, формируя группы из 6-8 частиц – нуклеомеры (супербусины)диаметром 25-30 нм.

Последовательность аминокислот в C-домене гистона H1 гомологична первичной структуре некоторых регуляторов транскрипции. В связи с этим предполагается, что гистон H1 конкурирует с факторами транскрипции за связывание с линкерной ДНК, контролируя тем самым активность генов.

Третий уровень укладки ДНКпредставлен хроматиновыми фибрилламидиаметром 30 нм, которые хорошо видны в электронном микроскопе в интерфазных ядрах и митотических хромосомах. Они имеют суперспиральную структуру и содержат максимально сближенные между собой нуклеомеры. В формировании фибрилл диаметром 30 нм принимают участие гистон H1, а также негистоновые белки с HMG-доменом. За конденсацию хроматина в фибриллу диаметром 30 нм отвечает, прежде всего, C-концевой домен гистона H1. При этом первостепенное значение приобретает уже не взаимодействие гистона с ДНК, а взаимные связи гистоновых молекул между собой.

Образование нуклеомеров и хроматиновых нитей диаметром 30 нм вызывает дальнейшую компактизацию ДНК в 40-50 раз.

Четвертый уровень укладки ДНКобеспечивается взаимодействием фибрилл диаметром 30 нм с ядерным матриксом. При этом формируются петлевые домены, содержащие в среднем 90 тысяч пар нуклеотидов. В расправленном состоянии их длина может достигать 20 мкм. Концы таких петель прикреплены к ядерному матриксу в особых точках, обозначаемых как MARs (matrix attachment regions) или SARs (scaffold attachment regions). Эти точки содержат молекулы свободной ДНК (“форум-ДНК”) длиной 50-150 пар нуклеотидов, которые устойчивы к действию нуклеаз и выделяются из ядра независимо от высокомолекулярной ДНК. Точки MARs содержат также топоизомеразу II, участвующую в формировании изгибов ДНК. Со стороны ядерного матрикса прикрепление хроматиновых нитей обеспечивается ламином A.

Петлевые домены являются типовой структурно-функциональной единицей хроматина. Домен во многом автономен, независимо реплицируется и транскрибируется. В своем составе домены имеют кластеры генов, которые связаны функционально. Петлевые домены обеспечивают компактизацию молекулы ДНК в 700 раз.

Пятый уровень укладки ДНКсвязан с формированием групп из 18-20 петлевых доменов, прикрепленных в виде розетки к общему центру из белков ядерного матрикса. Розетки из петлевых доменов находятся в хроматине в компактном состоянии, образуя округлые гранулы диаметром около 150 нм – хромомеры. При активации локализованных в хромомере генов его величина может возрастать до 300 нм и более.

Шестой уровень укладки ДНКопределяется формированием хромонемы – фибриллярной структуры диаметром 200-300 нм, состоящей из плотно упакованных хромомеров.В хроматине интерфазного ядра хромонемы обычно не выявляются. Они становятся видимыми только при конденсации хроматина в профазе митоза, а также в ранней телофазе при деконденсации хромосом. Хромомерный и хромонемный уровни укладки позволяют укоротить длину молекулы ДНК в 10 000 раз.

Седьмой уровень укладки ДНКсостоит в образовании хроматид (однохроматидных хромосом) из хромонем. Толщина хроматиды составляет в среднем 700-800 нм. Если учесть, что толщина хромонемы обычно равна 100-200 нм, то коэффициент упаковки для хромосомного уровня составляет не более 10. Способ укладки хромонемы в хромосоме изучен недостаточно. У одних видов хромонема имеет вид спирали, у других в одной хромосоме могут обнаруживаться две и более параллельные друг другу хромонемы. Хромосомный уровень укладки ДНК в большей степени, чем другие уровни, отражает видовые особенности организации генома эукариот.

Каждый вид, как известно, имеет характерный для него набор хромосом. Однако хромосомы можно наблюдать в микроскоп только при делении клеток митозом или мейозом. В ядрах неделящихся клеток хромосомы находятся в деконденсированном состоянии, образуя хроматин. Тем не менее, даже в интерфазном ядре хромосомы сохраняют свою индивидуальность, занимая в нем определенные хромосомные территории. Согласно К. Раблю (1885) хромосомы прикреплены к нуклеолемме теломерными концами, тогда как центромерные участки располагаются ближе к центру ядра. Новейшие исследования интерфазного ядра с помощью конфокальной микроскопии подтверждают эту концепцию, добавляя к ней ряд существенных деталей. В частности, гомологичные хромосомы локализованы на противоположных сторонах ядра. При активации генов и сопутствующей этому деконденсации хромосомы удлиняются, смещаясь к центру ядра. Вот почему в животных и некоторых растительных клетках гетерохроматин концентрируется преимущественно по периферии, тогда как эухроматин занимает центральную область ядра.

Ядрышко

Ядрышко выявляется внутри ядер в живых и фиксированных клетках как округлое тельце диаметром 1-5 мкм. Основным химическим компонентом ядрышка являются белки, которые составляют до 90 % его массы. Кроме белков они содержат также РНК (10-16 %) и ДНК (до 8 %). Ядрышко способно отделяться от хроматина и удерживать при этом участки ДНК, связанные с ним.

Крупные ядрышки обнаруживаются у всех активно синтезирующих белки клеток, которые отличаются базофилией цитоплазмы из-за большого числа рибосом. Подобная картина наблюдается как в интенсивно делящихся клетках, так и в неделящихся клетках, для которых характерна продукция большого количества белка (например, в железистом эпителии). Ядрышки отсутствуют в клетках дробящихся яиц, а также в некоторых высокодифференцированных клетках со сниженным уровнем метаболизма (например, в лейкоцитах крови).

Ядрышко является местом синтеза рРНК и образования предшественников рибосом. В нем выделяют следующие структурные компоненты:

ядрышковый организатор (фибриллярный центр);

плотный фибриллярный компонент;

гранулярный компонент;

околоядрышковый гетерохроматин;

белковый сетчатый матрикс;

Ядрышковый организатор, морфологически выявляемый в виде фибриллярного центра, представляет собой хроматин, в котором локализованы гены рРНК. Он является наиболее стабильной частью ядрышка и сохраняется при делении клетки, когда функционирование ядрышек временно прекращается. Ядрышки клеток человека могут содержать до 30 фибриллярных центров.

В электронном микроскопе фибриллярные центры выглядят как небольшие округлые образования низкой электронной плотности, образованные фибриллами диаметром 2-3 нм. Эти фибриллы представляют собой нити ДНК, содержащие неактивные гены рРНК. Активно транскрибируемые гены рРНК локализуются по периферии фибриллярных центров.

Рибосомные гены представлены в геномах эукариот сотнями и тысячами копий. У человека имеется 540 копий рибосомных генов, но в ядрышке активируется не более 140. У амфибий число копий может достигать 20 000. Рибосомные гены собраны в кластеры, локализованные в районах вторичных перетяжек хромосом.

Фибриллярные центры отличаются пониженным содержанием гистона H1 и избирательно импрегнируются AgNO₃. Это свойство фибриллярных центров обусловлено особыми белками, которые содержат аминокислоту диметиларгинин и сильно фосфорилированы.

Плотный фибриллярный компонентокружает фибриллярные центры, отличаясь от них повышенной электронной плотностью. Он образован фибриллами диаметром 4-8 нм, содержащими РНК. Эти фибриллы состоят из высокомолекулярного предшественника рРНК (45S пре-рРНК), который образуется на границе с фибриллярным центром путем транскрипции рибосомных генов РНК-полимеразой I. Они также содержат рибосомные белки, которые связываются с первичным транскриптом.

В дальнейшем происходит расщепление предшественника рРНК на более короткие фрагменты при помощи нуклеаз. Специфическими маркерами процессинга рРНК являются белки нуклеолин и фибрилларин.

Гранулярный компонент состоит из гранул размером 15-20 нм, которые заполняют пространство вокруг фибрилл, занимая до 80 % объема ядрышка. Эти гранулы содержат РНК и белки и являются предшественниками субъединиц рибосом различной степени зрелости. Маркерным белком сборки предшественников рибосом является полипептид B23.

Гранулярный компонент возникает в результате расщепления фибриллярного компонента. Если обработать клетки антибиотиком актиномицином D, который подавляет синтез РНК, то происходит сегрегация фибриллярного и гранулярного компонентов и постепенная деградация последнего. Иногда фибриллярный и гранулярный компоненты ядрышка образуют комплекс удлиненных тяжей шириной до 200 нм – нуклеолонему.

Околоядрышковый гетерохроматин окружает ядрышко по периферии, но может также заходить в него между петлями нуклеолонемы. В электронном микроскопе видно, что он состоит из хроматиновых фибрилл диаметром 30 нм. Околоядрышковый гетерохроматин, вероятно, определяет локализацию ядрышка в клеточном ядре.

Белковый сетчатый матрикс выявляется в ядрышке после экстракции из него РНК, ДНК и белков. Он представлен рыхлой фибриллярной сетью, которая заполняет весь объем ядрышка. Белковый матрикс ядрышка является составной частью ядерного матрикса.

В некоторых клетках вблизи от ядрышек располагаются тельца Кахаля (клубочковые тельца) - округлые аргирофильные образования диаметром от 100 нм до 1 мкм. Они были открыты в нейронах головного мозга млекопитающих испанским цитологом С. Рамон-и-Кахалем в 1903 г. Позднее они были обнаружены также в клетках растений, насекомых и амфибий. В эмбриональных клетках тельца Кахаля формируют парную структуру – gem. В последнее время установлено, что эти органоиды содержат ферменты, регуляторные белки и рибонуклеопротеиды, принимающие участие в транскрипции ДНК. Специфическим маркером телец Кахаля является белок коилин с молекулярной массой 80 кД. Предполагается, что тельца Кахаля, тесно взаимодействуя с ядрышками, обеспечивают созревание транскриптосом - особых органоидов, обеспечивающих транскрипцию гистоновых и других крупных генных локусов. На роль транскриптосом претендуют интерхроматиновые гранулы.

ВКЛЮЧЕНИЯ

В отличие от органоидов включения рассматриваются как необязательные (временные) компоненты клетки. Тем не менее, они широко распространены в клетках простейших, растений и животных. Как правило, включения возникают при накоплении в клетке большого количества какого-либо органического или неорганического вещества. Если вещество поступает в клетку извне, такие включения называются экзогенными.Выведенные из метаболизма продукты самой клетки могут формировать эндогенные включения. Особый тип представляют собой вирусные включения, которые наблюдаются у инфицированных вирусами клеток. Хотя они и возникают в результате синтетической деятельности клетки, первичным источником этих включений является вирусный геном, который проникает в клетку извне.

Включения имеют различные размеры и форму и могут обнаруживаться как в цитоплазме, так и в ядре, Пользуясь только световым микроскопом, включения трудно отличить от органоидов. С помощью электронного микроскопа можно, однако, убедиться в том, что включения не имеют собственной мембранной оболочки и располагаются непосредственно в гиалоплазме, ядре или матриксе митохондрий и пластид. Природу включений можно установить, используя цитохимические методы.