Эндонуклеазы рестрикции

Ферменты – инструменты генетической инженерии

Успехи фундаментальных исследований в области структурной и функциональной молекулярной биологии и генетики создали надежный базис для развития моделирования природных процессов в условиях in vitro. В условиях in vivo инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Технология рекомбинантной ДНК потому и называется технологией или генетической инженерией, что использует инструменты, обеспечивающие реализацию генетических процессов в природе. Никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты. Только они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты созданы природой для живой клетки, в которой они выполняют работу по репликации ДНК при делении клетки, репарации, в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера или молекулярного биотехнолога - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком ДНК.

Следует отметить, что ферменты, применяемые в генетической инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.

Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно объединить в несколько групп:

- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (эндонуклеазы рестрикции или рестрицирующие эндонуклеазы);

- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Эндонуклеазы рестрикции

Основными ферментами, которые позволяют производить различные манипуляции с нуклеиновыми кислотами, являются нуклеазы – ферменты, гидролизующие фосфодиэфирную связь (фосфодиэстеразы). Нуклеазы специфическим образом модифицируют молекулы ДНК и РНК внутри (эндонуклеазы) и на концах (экзонуклеазы) полинуклеотидной цепи. Нуклеазы могут гидролизовать, т.е. разрушать, полинуклеотидную цепь с одной или другой стороны от фосфодиэфирного мостика. Каждый фермент проявляет определенную специфичность в этом отношении. Существуют, например нуклеазы, специфичные в отношении одноцепочечной ДНК: exo VII E.coli.; или нуклеазы, специфично расщепляющие РНК в комплексе ДНК-РНК: РНКазы Н.

Рестрицирующие эндонуклеазы (эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы) - это ферменты, узнающие и гидролизующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции).

Еще в 1953 году было обнаружено, что ДНК определенного штамма E. coli, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В - в клетки штамма С) не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на мелкие фрагменты. В 1966 году было показано, что это явление связано со специфической модификацией хозяйской ДНК - она содержит несколько метилированных оснований, отсутствующих в немодифицированной ДНК, причем метилирование (добавление к основанию метильной группы) происходит уже после завершения репликации. Бактерия способна отличить свою собственную ДНК от любой вторгающейся “чужеродной” именно по типу ее модификации. За “метку” отвечают метилирующие ферменты модификации, так называемые ДНК-метилазы. Различие в модификации делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестрицирующих ферментов, которые узнают отсутствие метильных групп в соответствующих сайтах.

Системы рестрикции (restriction – ограничение), т.е. ограничения действия чужеродного генетического материала, и модификации широко распространены у бактерий; их существование играет важную роль в защите резидентной ДНК от загрязнения последовательностями чужеродного происхождения.

Первая специфическая эндонуклаза была выделена Смитом и Вилькоксом из Hyamophilus influenzae (Hind III) в1970 году. А в 1978 году Вернер Арбур, Даниелс Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине “За обнаружение рестрикционных ферментов и их применение в молекулярной генетике”.

Поскольку разные бактерии по-разному метят свою ДНК, то и эндонуклеазы рестрикции должны узнавать разные последовательности. На настоящий момент описано приблизительно 500 эндонуклеаз рестрикции. Для всех этих ферментов обнаружено около 150 сайтов узнавания ДНК.

Номенклатура

Ферменты рестрикции-модификации именуются в соответствии с системой, предложенной в 1973 году Смитом и Натансом.

1. Название фермента начинается с трехбуквенного акронима, в котором первая буква совпадает с первой буквой названия рода, а остальные – с первыми двумя буквами вида организма, в котором данный фермент был обнаружен. Акроним пишется курсивом.

2. Дополнительные буквы служат для обозначения конкретного штамма или серотипа.

3. Римские цифры присваиваются в порядке обнаружения ферментов данного типа у конкретного организма. Дополнительные буквы и цифры курсивом не выделяются, но отделяются пробелом.

Например:

Bsu I – фермент первой системы рестрикции-модификации, обнаруженной у Bacillus subtilis

Eco R V – фермент пятой системы рестрикции-модификации, охарактеризованной у Escherichia coli штаммаRY13.

В учебной и научной литературе наблюдаются значительные различия в написании названий одних и тех же ферментов рестрикции-модификации (в плане курсивного выделения и наличия пробелов). В связи с этим в 2003 году большая группа ученых предложила систематизировать классификацию и номенклатуру ферментов рестрикции-модификации.

1. Предложено отказаться от использования курсива.

2. Все название должно писаться без пробелов.

3. Рекомендовано избегать названий “рестриктаза” и “метилаза”, употребляя вместо этого “эндонуклеаза рестрикции” и “метилтрансфераза”.

4. В случае необходимости, тип ферментативной активности указывать буквами R (эндонуклеазная) и М (метилтрансферазная) перед акронимом – M.EcoRI и R.EcoRI