Лигирование по "тупым" концам

Тупые концы также можно соединенять с помощью ДНК-лигазы, если и фермент, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях (рис. 13) В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 году Полем Бергом в Стенфордском университете, США.

Липкие концы можно присоединить к фрагментам ДНК с тупыми концами ферментативным путем. Для этого используют фермент терминальную трансферазу из тимуса теленка, который присоединяет нуклеотиды к 3’-концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента — олиго (dT)-сегменты примерно такой же длины, то при объединении полученных таким образом фрагментов происходит комплементарное спаривание за счет образования водородных связей между олиго (dА)- и олигo (dT) -последовательностями (рис. 15). Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК, который получил название коннекторный метод.

 

Рис. 15. Создание «липких» концов и сшивка фрагментов ДНК коннекторным методом

 

Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно используют коннекторный метод. При таком способе соединения между фрагментами встраиваются участки ААААА. Такие дополнительные последовательности ТТТТТ могут влиять на функции соединяемых молекул и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия эндонуклеаз рестрикции.

 








Дата добавления: 2016-02-09; просмотров: 980;


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам перенёс пользу информационный материал, или помог в учебе – поделитесь этим сайтом с друзьями и знакомыми.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2024 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.004 сек.