Сибиреязвенный токсин относится к наиболее изученным трехсоставным А1-В-А2-токсинам.
Основной мишенью его являются макрофаги,а также подобные им клетки, имеющие к нему высоко аффинные рецепторы. Общая В-субъ-единицатоксина, являющаяся протективным антигеном,обеспечивает ферментативным субъединицам единый механизм проникновения в цитозоль клетки, что необходимо для синергидного действия последних. Вначале протективный антиген связывается с высоко аффинными рецепторами эукариотических клеток. Затем под действием фурина — про-теазы клетки-мишени из него образуется активная форма, имеющая молекулярную массу 63 кД (ПА 63), которая, образуя гептамеры, связывающие летальный фактор (А 1)и отечный фактор(А2), участвует в формировании рН ионопроводящих (катионселективных) каналов и транслокации А1 и А2 в цитозоль клетки путем рецепторного эндоцитоза. Летальный фактор— металлопротеаза, мишенью которой служит митогенанактивируемая киназа протеинкиназ. Он оказывает свое действие в течение нескольких минут, перемещаясь из прелизосомного пространства в лизсому через кислотное внутриклеточное окружение. Действие летального фактора проявляется в продуцировании активных форм кислорода в макрофагах и нейтрофилах, что сопровождается увеличением перекисных соединений в макрофагах и деструкции последних (цито-токсическое действие). Отечный факторбиохимически является зависимой от кальция и кальмодулина аденилатциклазой,образуемой микоробами в неактивной форме. Она активируется при внутликлеточном контакте а белком эукариотов — кальмодулином, отсутствующим у бактерий. Ее мишенью является АТФ. Аденила гциклаза индуцирует синтез вторичных мессенджеров.Повышение уровня цАМФ в клетках сопровождается угнетением фагоцитарной функции клеток, нарушением слияния фагосомы с лизосомой, обезвожива-
нием клеток и экскреции источников энергии в результате нарушения проницаемости клеток. Очевидно, цАМФ используется бактериями для подавления многих нормальных функций фагоцитов, что позволяет микробам дольше выживать во внутренней среде макроорганизма. При этом развитие сибиреязвенной инфекции предполагает обязательное совместное участие всех трех компонентов сибиреязвенного токсина.
Активаторы иммунного ответа.К данной группе токсинов относятся: токсин синдрома токсического шока (TSST-1), энтероток-сины и эксфолиативные токсины S. aureus, пирогенные экзотоксины S. pyogenes и ряд токсинов других микробов. Они относятся к суперантигенам (PTSAg) и могут действовать непосредственно на антигенпрезентуюшие клетки иммунной системы (АРС) и Т-лим-фоциты. Их иммуностимулирующий эффект является результатом способности связывать различные участки экспрессированных на поверхности АРС МНС 2 класса снаружи от пептидсвязывающего участка и специфических VP-элементов на Т-клеточном рецепторе. Например, beta-домен стафилококкового TSST-1 связывает аlfa-цепь МНС 2 класса на макрофагах, в то время как А-домен специфически связывается с Vbeta2-элементами рецепторов Т-клеток, что ведет к массивной пролиферации Т-клеток, сопровождающейся образованием большого количества лимфоцитарных (интерлейкин-2, у-интерферон), а также мо-ноцитарных цитокинов (интерлейкин-1, ин-терлейкин-6, а-фактор некроза опухолей). Совместно эти цитокины вызывают развитие гипотензии, высокую температуру и диффузную эритематозную сыпь. Стафилококковый эксфолиативный токсин (син. эксфолиатин, эпидермолитический токсин) разрушает межклеточные контакты (десмосомы) зернистого слоя эпидермиса, что ведет к отслоению (десквамации, эксфолиации) поверхностных слоев эпидермиса и образованию лопающихся пузырей, наполненных серозным или гнойным содержимым.
Бактериальные токсины сходны по структуре и целому ряду других свойств с сигнальными молекулами макроорганизма: гормонами, нейромедиаторами, интерферонами и т. д.
В ходе лиганд-рецепторного взаимодействия с клетками макроорганизма они используют уже готовые структуры, участвующие в нейро-эндокринной сигнализации. Формирование пор тоже не является их уникальным свойством. Можно предположить, что, являясь антиметаболитами сигнальных молекул макроорганизма, они первоначально имитируют их действие, а в последующем оказывают блокирующий эффект.
Универсальность белковых токсинов заключается в их полифункциональности, не ограничивающейся их значением только лишь как факторов патогенности. Образование белковых токсинов играет существенную роль в экологии бактерий, их существованию в природных биоценозах, где они играют роль сигнальных молекул и оказывают токсическое воздействие на эукариотические клетки грибов и простейших. Благодаря сходству строения с бактериоцинами, они оказывают токсическое воздействие и на конкурентов, в том числе представителей нормальной микрофлоры макроорганизма. Обладая ферментативной активностью, они выполняют трофическую функцию жизнеобеспечения самой микробной клетки.
В отличие от эндотоксинов, белковые токсины, помимо химической структуры и специфичности действия, обладают высокой токсичностью. Они вызывают гибель лабораторных животных при введении им всего нескольких микрограммов токсина, тогда как эндотоксины вызывают гибель животных при введении доз, равных сотням микрограмм. Как и вирулентность, сила действия белковых токсинов измеряется величиной летальных доз (LD) — Del, Dlm и LD50. Это полноценные тимуеза-висимые антигены, к ним образуются антитела, нейтрализующие их — антитоксины. При этом фрагменты А и В в антигенном отношении не идентичны. Протективным действием обладают антитела к С-терминальной части фрагмента В, блокирующие прикрепление токсина к специфическому рецептору клетки. Из белковых токсинов можно получить анатоксины, т. е. токсины, лишенные своих токсических свойств, но сохранивших антигенные свойства, что используют при проведении вакцинопрофилактики. Одним из методов
получения анатоксинов является формоловая детоксикация по G. Ramon (1923), приводящая к химической модификации активного центра токсина и обуславливающая жесткость структуры белковой молекулы, препятствующей ее диссоциации. Заболевания, при которых микроорганизм остается в месте входных ворот инфекции, а в основе патогенеза заболевания и его клинических проявлений лежит действие белкового токсина, называются токсинемическими инфекциями (анаэробная раневая инфекция, столбняк, ботулизм, дифтерия). Такое разделение заболеваний имеет важное значение как в плане проведения микробиологической диагностики, так и лечения, поскольку наиболее эффективными препаратами для специфического лечения токсинемических инфекций являются не антибиотики, а своевременно применяемые антитоксические сыворотки, в ряде случаев сочетаемые с введением анатоксинов (пассивно-активная терапия). Использование антибиотиков, которые действуют на бактерии, а не на их токсины, уходит на второй план. В качестве же средств специфической профилактики токсинемических инфекций для создания искусственного активного приобретенного иммунитета необходимо применять анатоксины, а для создания искусственного пассивного приобретенного иммунитета в целях экстренной профилактики токсинемических инфекций необходимо применять антитоксические сыворотки {активно-пассивная профилактика).
Большинство белковых токсинов разрушается пищеварительными ферментами и оказывает свое воздействие только при парентеральном введении. Исключение составляют токсины С. botulinum, энтеротоксины С. perfringens, С. difficile, S. aureus и энтеротоксины грамот -рицательных бактерий, проявляющих свое действие при пероральном поступлении в макроорганизм.
Синтез белковых токсинов кодируется генами, локализованными в хромосоме и сцепленными с генами, участвующими в спорообразовании или входящими в состав профага, а также генами, локализованными в плазмидах. Это tox+ гены, ответственные за токсиген-ность. Активность tox+ генов контролирует-
ся белками-репрессорами микробной клетки. Первоначальной функцией этих генов у сапрофитов был синтез структурных белков фага, компонентов оболочек спор или синтез ферментов, необходимых для усвоения аминокислот. По мере закрепления паразитического образа жизни эти специализированные адаптивные ферменты превратились в яды — белковые токсины.
Способность микроорганизмов образовывать белковые токсины необходимо учитывать также при проведении микробиологической диагностики. При этом необходимо помнить, что все патогенные штаммы данного вида могут продуцировать только один тип токсина по антигенной структуре и механизму действия(С. diphtheriae, С. tetani), разные по антигенной структуре, но одинаковые по механизму действия токсины (С. botulinum). С другой стороны, один и тот же вид микроба может образовывать разные типы белковых токсинов, а также эндотоксины, например диареегенные Е. coli, шигеллы и сальмонеллы, возбудитель холеры.
Эндотоксины и их биологические свойства. Свойство бактерий образовывать токсические вещества, вызывающие симптомы интоксикации, в том числе выделять в окружающую среду при их разрушении эндотоксины, называется токсичностью. Эндотоксины относятся к бактериальным модулинам, обладающим огромным спектром биологической активности, индуцирующим синтез цитокинов и других медиаторов. В отличие от белковых токсинов, эндотоксины термостабильны и образуются грамотрицатель-ными бактериями, выделяясь в окружающую среду только после гибели бактериальной клетки. Это сложные белковолипополисахаридные комплексы, которые в лабораторных условиях можно получить путем экстракции трихло-руксусной кислотой по Буавену (A. Boivin) и Месробяну (L. Mesrobeanu). Полный антиген, антиген Буавена содержит до 10 % белка. Он входит в состав клеточной стенки грамотри-цательных бактерий. Данные комплексы состоят из белка — пептида, обуславливающего иммуногенность комплекса; фосфолипида В, включающего в свой состав фосфатидилхо-лин — основной компонент клеточной стенки бактерий; двухвалентных ионов Са и Mg; ЛПС,
входящего в состав наружной мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий, который и является собственно эндотоксином, его основным компонентом (липополисахарид-ная фракция полного антигена, без белкового компонента). В наиболее чистом виде ЛПС получают путем водно-фенольной экстракции по Вестфалю (О. Westphal). Карболовая кислота разрушает белки. ЛПС состоит из липида А и собственно полисахарида, в состав которого входит базисная часть — R-ядро, образованное 3-дезокси-D-манно-октулозоновой кислотой и остатками гептоз, а также О-специфичес-ких олигосахаридных цепей, обуславливающих антигенную специфичность ЛПС грамотрицательных бактерий. Липид А и R-ядро полисахарида имеют одинаковое строение у всех грамотрицательных бактерий, за исключением
B. pertussis, В. abortus, В. fragilis, P. aeruginosa,
C. violaceum, R. viridis, R. tenue, у которых они об
ладают ярко выраженной индивидуальностью.
Синтез отдельных компонентов ЛПС происходит
в бактериальной клетке независимо и контроли
руется генами, локализованными в хромосоме.
Вирулентные бактерии синтезируют полную
структуру ЛПС и образуют S-форму микроба, у
которой О-специфические цепи составляют 2/3
ЛПС. Бактерии со сниженной вирулентностью
не имеют О- специфических цепей и образуют
R-формы микроба. Они имеют многочислен
ные бреши во внешней мембране, что сопро
вождается нарушением ее проницаемости.
За проявления биологической активности эндотоксинов ответственна вся молекула ЛПС, а не отдельные его компоненты. В отличие от белковых токсинов, они не обладают органотропностью и специфичностью действия. Симптомы интоксикации при заболеваниях, вызванных грамотрицательными бактериями, однотипны, и связаны с действием образующихся медиаторов воспаления. В основе действия ЛПС лежит его неспецифическое липид-липидное и специфическое, за счет рецепторов CD14, взаимодействие с мембранными компонентами разных типов клеток: тромбоцитов, гранулоцитов, эритроцитов, лимфоцитов, моноцитов и макрофагов, которые под действием ЛПС выделяют биологически активные вещества. ЛПС запускает в макроорганизме синтез более 20 различ-
ных биологически активных веществ, которые обуславливают патогенез эндотоксикоза и обладают пирогенным действием. Основной точкой его приложения являются макрофаги. Образование больших доз эндотоксина сопровождается угнетением фагоцитоза, явлениями выраженного токсикоза, слабостью, одышкой, диареей, нарушением сердечнососудистой системы, снижением давления, гипогликемией, лейкопенией, сменяющейся лейкоцитозом, агрегацией тромбоцитов, гипотермией. При образовании больших количеств эндотоксина в крови вследствие усиленного разрушения большого количества гра-мотрицательных бактерий возможно развитие эндотоксинового шока. При образовании небольших доз эндотоксина отмечается слабый токсикоз и повышение температуры тела, стимуляция фагоцитоза. ЛПСотносится к ти-муснезависимым антигенам и вызывает поли-клональную стимуляцию В-лимфоцитов, активирует систему комплемента по альтернативному пути, является адъювантом. Небольшие дозы эндотоксина, образующиеся постоянно представителями нормальной микрофлоры тела человека в кишечнике, оказывают благоприятное стимулирующее воздействие на клетки иммунной системы макроорганизма, что ведет к повышению неспецифической резистентности макроорганизма, усилению его устойчивости к инфекционным заболеваниям, повышению радиорезистентности и увеличению противоопухолевой активности клеток. В результате поликлональной стимуляции и активации системы комплемента по альтернативному пути макроорганизм находится в постоянной готовности к встрече с самыми разнообразными микробами и может противостоять им до образования специфических факторов защиты. С другой стороны, длительное присутствие поликлонального стимулятора в макроорганизме может вести к включению запретных клонов клеток и развитию аутоиммунных реакций. В ходе иммунного ответа первоначально на введение ЛПСобразуются О-антитела, которые не обладают антитоксической активностью. Симптомы интоксикации уменьшаются после образования антител к R-ядру полисахарида и липиду А. Так как они имеют одинаковое строение у
грамотрицательных бактерий, то антитела к ним пытаются применять для лечения септических процессов, вызванных данными микробами. В отличие от белковых токсинов, из эндотоксинов нельзя получить анатоксины.
Изучение антигенной специфичности ЛПСиспользуется при проведении идентификации грамотрицательных бактерий.
Кроме токсинов, в ходе инфекционного процесса в результате размножения микробы образуют целый ряд других токсических продуктов метаболизма, такие как ядовитые амины, холин, нейрин, высшие жирные кислоты и т. д. Одновременно с их действием происходит отравление организма токсическими продуктами распада собственных клеток и тканей, что играет важную роль в развитии интоксикации.
Таким образом, патогенность носит сложный полидетерминантный характер. Основными материальными носителями патогенности микробов являются морфологические структуры клетки, ферменты и токсины. Вмакроорганизме они оказывают не изолированное, а комплексное воздействие. Например, ней-раминидаза холерного вибриона способствует адгезии возбудителя к эпителиальным клеткам слизистой оболочки тонкого кишечника и взаимодействию его энтеротоксина с ганглиозид-ными рецепторами клеток, а гемо-цитолизин, образуя каналы в мембране клеток, ведет к их осмотическому повреждению и делает адени-латциклазу клеточных мембран более доступной. Показана относительность деления факторов патогенности по их функциям. Один и тот же фактор патогенности может участвовать в различных фазах инфекционного процесса, а в одной и той же фазе могут участвовать различные факторы патогенности. Например, капсулы бактерий способствуют их адгезии, препятствуют фагоцитозу и экранируют компоненты клетки, активирующие комплемент по альтернативному пути. Эндотоксины и ин-вазивные белки грамотрицательных кишечных бактерий не только способствуют их инвазии и развитию симптомов интоксикации, но и защищают бактерии от действия соляной кислоты и ферментов в желудке. В основе действия всех факторов патогенности лежат одни и те же принципиальные закономерности, связанные
со способностью активных биомолекул возбудителя (лигандов) к распознаванию на клетках-мишенях комплементарных структур, связывание с которыми ведет к инициации развития инфекционного процесса, патологические проявления которого связаны с синтезом тех или иных ферментов и токсинов. Факторы патогенности используются микробами не только в макроорганизме, но и при их попадании в окружающую среду с целью колонизации ее объектов и сохранения жизнеспособности в борьбе с конкурентами.
8.3.3. Генетическая регуляция факторов патогенности
Патогенность бактерий носит полиде-терминантный характер и контролируется группой генов. Большинство генетических детерминант факторов патогенности располагается на хромосомахотдельными кластерами из функционально связанных групп генов. Эти последовательности отличаются от большей части генома, что позволило выдвинуть предположение об их чужеродном происхождении. Подобные им структуры были также найдены на плазмидах.
При этом наблюдается своеобразное разделение функций между хромосомой и плаз-мидами. Например, у шигелл и энтероинва-зивных кишечных палочек плазмидные гены обуславливают взаимодействие возбудителей с эпителием, а хромосомные — существование и размножение бактерий в просвете кишки и тканях. Эти данные позволили выдвинуть концепцию о ведущей роли «островов» (islands) или «островков» (islets) патогенности и системе секреции факторов патогенности 3-го типа.
Под «островками» патогенности принято понимать как не стабильные, так и стабильные участки ДНК, обнаруженные только у патогенных бактерий, включающие дискретные (разобщенные, состоящие из отдельных групп) гены вирулентности. Они отсутствуют у непатогенных близкородственных видов.
Эти фрагменты ДНК отличаются по процентному содержанию G+C от основного генома, фланкированы малыми прямыми повторами нуклеотидных последовательностей. Такие «островки» патогенности нередко несут криптические или функционирующие гены фаговых интеграз, транспозаз и других фрагментов транспозонов или IS-элемен-тов, относимых к мобильным генетическим элементам. Структурная организация «островков» может быть различной, так как гены вирулентности часто включены в состав транспозонов, IS-элементов или генома бактериофагов. Детерминанты «островков» патогенности способны распространяться среди одного или родственных видов бактерий путем конъюгации, трансдукции и трансформации. Интеграция, стабилизация и экспрессия этих генов лежат в основе формирования новых свойств, в том числе вирулентных, у родственных непатогенных видов. Известны «островки» патогенности, несущие гены ад-гезинов, инвазинов, различного типа токсинов, генов лекарственной устойчивости, белков системы секреции и т. д.
Прежде чем достичь своей потенциальной мишени, факторы патогенности преодолевают два основных барьера — цитоплазмати-ческую мембрану и клеточную стенку микробов-продуцентов. При этом большая часть их после секреции становится функционально активной. Поэтому большое значение придают системе секреции третьего типа.
Система секреции 3-го типаответственна за одноэтапный транспорт эффекторных молекул патогенности из цитоплазмы бактерий в цитозоль эукариотической клетки макроорганизма, где они осуществляют модификацию цитоплазматических белков поражаемых клеток макроорганизма.
Данная система также обеспечивает сборку на поверхности бактериальной клетки супермолекулярных структур, участвующих в транспорте протеинов в эукариотическую клетку макроорганизма. Секреция эффекторных белков данной системой происходит непосредственно после контакта возбудителя с
клеткой хозяина, поэтому ее называют контакт-зависимой системой секреции.
«Островки» патогенности могут включать несколько различающихся фрагментов. Экспрессия генов вирулентности носит ин-дуцибельный характер и зависит от условий внешней среды, вне- или внутриклеточного расположения возбудителя. Описано несколько систем регуляции фенотипического проявления факторов патогенности у бактерий. Гены, детерминирующие их синтез, обычно репрессированы. Включение или выключение их происходит под действием сигналов, поступающих из внешней среды. Такими сигналами являются изменившийся биохимический состав среды, ее рН, температура, осмотическое давление и т. д. Микробы адаптируются к новым условиям и в зависимости от своего внутри или внеклеточного расположения изменяют свой метаболизм. Обычно они используют один или несколько из этих сигналов для того, чтобы понять, в какой микросреде и на какой стадии развития инфекционного процесса они находятся. Например, гены инвазии обычно включаются на ранней стадии инфекционного процесса, но подавляются, когда бактерии проникают в клетку. Процесс адаптации микроба к новым, меняющимся условиям контролируется двухкомпонентными регуляторными системами. Эти системы состоят из двух типов белков: сенсорного белка клеточной мембраны, воспринимающего и передающего сигналы из внешней среды внутрь клетки, и регуля-торного цитоплазматического белка, который непосредственно регулирует транскрипцию генов хромосомы и плазмиды, являясь активатором или репрессором транскрипции. Внутриклеточный домен сенсорного белка представлен гистидинкиназой. В качестве соответствующего сигнала может выступать аутофосфорилирование сенсора. Перенос фосфат-остатка на аминогруппу белка-регулятора изменяет способность последнего связывать специфические последовательности ДНК, с которых инициируется транскрипция. Эти последовательности содержат консервативные начальные участки для связывания с белком-регулятором. Включение и активация группы вирулентных генов (регулона) на об-
щий сигнал происходит в несколько стадии и носит каскадный принцип. В ряде случаев каждый из этих генов может экспрессиро-ваться независимо.
Помимо двухкомпонентных регуляторных систем существуют также системы регуляторов транскрипции.Наиболее полно изучено Аго А-семейство регуляторов транскрипции, получивших свое название благодаря продукту ага С гена Е. coli, контролирующего функцию арабинозного оперона. Белки этой группы содержат изгибы, которые связываются с началом специфических ДНК-фрагментов генов, что активирует транскрипцию последних.
К регуляторному механизму относят также топологию ДНК, рассматриваемую в качестве глобальной регуляторной системы, используемой и для экспрессии вирулентности. Реализуется указанное через топоизомеразы и гистоноподобные ДНК-связывающие белки, регулирующие уровень суперскрученности молекулы и реагирующие на определенные сигналы извне. Эти же сигналы влияют на транскрипцию соответствующих генов.
Все эти механизмы регуляции взаимосвязаны между собой. Значимость каждого из них постоянно меняется.
Нестабильность «островков» патогенности, как и их стабильность, способна создать бактериям определенные адаптивные преимущества. Высокая вирулентность может оказаться невыгодной для бактерий на определенной стадии инфекционного процесса. Нестабильность «островков» патогенности будет способствовать снижению вирулентности всей популяции возбудителя инфекции. Их делеция может усилить экспрессию других, рядом расположенных генов.
В то же время отдельные факторы патогенности являются адаптивными для бактерий, поэтому должны кодироваться - на стабильных «островках» патогенности. Чужеродность последних придает им большую стабильность, так как чужеродная ДНК, интегрированная в хромосому, не вовлекается в рекомбинацию с ДНК близкородственных микроорганизмов, поэтому они могут длительно поддерживаться в бактериальных популяциях.
Циклические фенотипические или моди-фикационные изменения вирулентности про-
исходят при смене организменной и внеорга-низменной стадии существования микробов. В иммунном организме и вне организма сохраняются маловирулентные резервационные штаммы. Попадая в макроорганизм, из них формируются высоковирулентные эпидемические штаммы. По мере формирования иммунитета из последних снова происходит формирование резервационных штаммов. Стойкие изменения вирулентности возникают в случае мутаций и рекомбинаций и связаны с изменениями генотипа микроба.
Реорганизация генов, кодирующих факторы патогенности, в ходе инфекционного про-лесса происходит на молекулярном уровне, но на популяционном уровне создаются условия хтя естественного отбора эпидемических, или резервационных, штаммов. Благодаря принципу распознавания кворума бактерии обладают способностью «разговаривать». Кворум генсинг — это химический сигнальный механизм бактерий, благодаря которому, попав в новую среду обитания, они считают себе подобных. Чем больше в округе бактерий, тем больше химических сигналов они выделяют. Чем больше концентрация химического сигнала, тем больше воспринимающих его рецепторов у бактерии работает. В том случае если бактерий много (кворум), они начинают синтезировать факторы патогенности и принимают воинственную вирулентную форму, которая может справиться с иммунной системой макроорганизма. Если же сил не хватает, то армия бактерий будет отсиживаться в засаде и ждать благоприятного момента. Знание механизмов кворум-сесинга позволяет по-новому подойти к лечению инфекционных заболеваний, в том числе вызванных антибиотико-резистен-тными штаммами бактерий.
Дата добавления: 2016-02-04; просмотров: 1696;