Лекция 13. СПИРОХЕТЫ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СПИРОХЕТ

Спирохеты (лат. spira – виток, греч. chaite – гребень, грива) отличаются от бактерий и грибов строением в виде штопорообразной извитой формы. Размеры их колеблются в больших пределах (ширина 0,3 - 1,5 мкм и длина 7 - 500 мкм).

Спирохеты – тонкие одноклеточные изогнутые или спиральные палочки. с рядом отличительных ультраструктурных особенностей, используемых в дифференцировании родов. Цитоплазма окружена цитоплазматической мембраной, пептидогликановый слой обеспечивает ригидность клетки и ее форму.

Нуклеоид спирохет не отделен от цитоплазмы ядерной мембраной. При электронной микроскопии обнаруживается нежная цитоплазматическая мембрана, в которой заключается цитоплазма. У спирохет нет клеточной стенки, характерной для бактерий, но при электронной микроскопии выявлено, что они имеют тонкую клеточную стенку (перипласт), который прилагает к цитоплазме. Спирохеты не образуют спор и капсул.

По Романовскому - Гимзе одни виды окрашиваются в синий, другие - в сине-фиолетовый, третьи - в розовый цвет. Хорошим методом обработки спирохет является серебрение. Тинкториальные свойства используют для дифференциации сапрофитов и патогенных спирохет.

В порядок Spirochaetales, семейство Spirochaetaceae входят сапрофиты и патогенные виды. К сапрофитам относятся Spirochaeta и Cristispira, представляющие собой крупные клетки размером 200 - 500 мкм; некоторые имеют крипты (волнистый гребни), концы их заострены или тупые; они обитают на мертвых субстратах, в загрязненных водоемах, в кишечнике холоднокровных животных. По Романовскому - Гимзе окрашиваются в синий цвет.

К патогенным относятся три рода: Treponema, Leptospira, Borrelia.

У трепонем видны тонкие цитоплазматические нити в бактериальной цитоплазме, в то время как у боррелий они отсутствуют. Представители обоих родов обладают активной подвижностью, у них несколько жгутиков присоединены к каждому полюсу клетки и обернуты вокруг бактериального тела клетки. В отличие от других подвижных бактерий, эти жгутики не выступают в окружающую среду, а находятся под наружной оболочкой бактерии. Жгутики трепонем сложно устроены и состоят из влагалища и сердцевины, в то время как жгутики у боррелий более просты и подобны жгутикам других бактерий. Наружная оболочка спирохет богата липидами, и, по крайней мере у некоторых трепонем, содержит мало белков и липополисахаридов. Это может объяснять чувствительность этих микроорганизмов к губительному действию детергентов и высушивания.

Хотя трепонемы относятся к грам-отрицательным микроорганизмам, они не окрашиваются по методу Грама, и при их исследовании используют специальные методы окраски. Кроме того, патогенные трепонемы не могут хорошо культивироваться на питательных средах, их поддерживают путем пассажа на чувствительных животных. В отличие от них, боррелии окрашиваются грам-отрицательно и многие патогенные виды могут культивироваться на обогащенных питательных средах, содержащих сыворотку.

Представители рода Borrelia отличаются от других спирохет тем, что клетки микроорганизмов имеют крупные отлогие неравномерные завитки, число которых колеблется от 3 до 10. Патогенными для человека являются возбудители возвратного тифа, передающегося вшами (Borrelia recurrentis) и клещами (Borrelia persica и др.). Они окрашиваются по Романовскому-Гимзе в сине-фиолетовый цвет.

Род Трепонема (Gk. trepein - поворот, nema - нить) представлен тонкими гибкими клетками с 6-14 завитками Концы трепонем сужены или закруглены, некоторые виды на полюсах имеют тонкие удлиненные нити. Помимо типичных форм могут встречаться трепонемы в виде гранул, кист, L-форм и других структур. Трепонемы окрашиваются по Романовскому-Гимзе в бледно-розовый цвет. Типовой представитель – возбудитель сифилиса Trepinema pallidum.

Микроорганизмы рода Leptospira (Gk. leptos тонкий, speira виток) характеризуются очень тонкой клеточной структурой. Лептоспиры образуют 12 – 18 мелких завитков плотно прилегающих друг к другу, формируя первичные спирали. Микроорганизмы имеют две парные осевые нити, прикрепленные к противоположным концам (к базальным тельцам) клетки и направил к друг другу. Средняя часть лептоспир не имеет осевых нитей. Из-за наличия двух пар осевых нитей лептоспиры способны к весьма сложному и активному движению. Во время движения концы микроорганизмов быстро вращаются под прямым углом к основной части тела. В покое концы загнуты крючкообразно, в то время как во время быстрого вращательного движения они походят на петлицы. Вторичные спирали придают лептоспирам вид скобок или буквы S. Цитоплазма слабо преломляет свет. Они окрашиваются в розовый цвет по Романовскому-Гимзе. Некоторые серотипы лептоспир являются патогенными для человека и вызывают лептоспироз.

Спирохеты не обладают ферментирующими свойствами, которые могут дать информацию для лабораторного диагноза и не продуцируют растворимые токсины.

2. TREPONEMA

Патогенные для человека трепонемы являются возбудителями венерического сифилиса и невенерических трепонематозов - фрамбезии, или явса, беджеля и пинты. Трепонемы, вызывающие эти различные инфекционные заболевания, морфологически идентичны – туго намотанные извитые палочки, 5-15 мкм длиной и 0.1-0.5 мкм в диаметре – обнаруживающие лишь едва уловимые антигенные различия. Дифференцирование этих микроорганизмов основывается прежде всего на вызываемых ими клинических синдромах и незначительных различиях в патологических процессах у экспериментальных животных.

Классификация трепонем представлена в таблице 1.

Таблица 1. Классификация патогенных для человека трепонем

Возбудитель сифилиса.

Treponema pallidum открыта в 1905 г. Ф. Шаудином и Э. Гофманом.

Морфология. Treponema pallidum - это спиральные нити с 8 - 14 равномерными завитками. Величина трепонем 10 - 13 мкм в длину и 0,13 - 0,15 мкм в ширину. В старых культурах трепонем обнаруживаются цистоподобные структуры. Размножение происходит путем поперечного деления.

Трепонемы подвижны (обладают вращательным, поступательным, сгибательным и волнообразным движением), плохо воспринимают красители. По методу Романовского - Гимзы окрашиваются в бледно-розовый цвет; это объясняется скудностью нуклеопротеидов в их теле.

Под влиянием факторов внешней среды и лечебных препаратов трепонемы в ряде случаев свертываются в клубки, образуя цисты, покрытые непроницаемой муциноподобной оболочкой; они длительное время могут находиться в организме больного в латентном состоянии; при благоприятных условиях цисты превращаются в зерна, а затем в типичные спиралевидные трепонемы. Цистообразование - одна из защитных форм трепонем, позволяющая им противостоять действию препаратов, применяемых для лечения больных сифилисом, особенно если они применяются в малых концентрациях и короткое время.

Культивирование. Бледная трепонема - весьма требовательный микроорганизм. Она не растет в обычных средах, развивается при температуре 35 °С в анаэробных условиях в средах, содержащих мозговую ткань; крайние границы роста 34 – 40 °С. Микроорганизмы растут на питательной среде, состоящей из двух частей 2 процентного агара, одной части асцитической жидкости, и кусочков стерильной почки кролика. Хорошо развивается бледная трепонема на хорионаллантоисной ткани куриного зародыша, в кроличьей сыворотке с добавлением кусочков мозговой ткани под слоем вазелинового масла.

Получение чистых культур трепонем представляет большие трудности. Продолжительное культивирование трепонем сопровождается утратой их вирулентности. Такие культуры, адаптированные к питательной среде, называются «культуральными» в отличие от «тканевых», обладающих свойствами патогенности и сохраняющихся в лабораторных условиях на кроликах путем пассажей. Культуральные и тканевые штаммы различаются между собой по антигенным свойствам.

Антигенная структура. Серологические варианты не установлены. Некоторые авторы утверждают, что имеются два варанта возбудителя сифилиса: дерматотропный и нейтротропный.. Однако, сомнительно, что такое дифференцирование имеет значение. T. pallidum не проявляет выраженного тропизма. Она влияет на различные органы и ткани, включая нервную систему.

Не вызывает сомнения, что существуют различные штаммы T pallidum, некоторые из них используются в лабораторной диагностике в качестве антигенов в реакции Вассермана.

Резистентность. Бледная трепонема в гомогенатах пораженных тканей длительно сохраняется на холоде. От действия температуры 45 - 48°С она погибает в течение 1 ч, при 55°С - через 15 мин; чувствительна к тяжелым металлам (ртуть, висмут, мышьяк), кислотам и другим дезинфицирующим веществам, а также к высушиванию.

Патогенность дляживотных. Бледная трепонема малопатогенна для животных, кроме обезьян. Получен положительный результат при заражении кроликов в роговую оболочку глаза или яичко. Благодаря экспериментальному сифилису изучены вопросы иммунитета, специфической химиотерапии и культивирования возбудителя сифилиса.

Патогенез заболевания у человека (табл. 1). Источник болезни - больной человек. Болезнь передается при прямом контакте, преимущественно половым путем, иногда через посуду и другие предметы. Сифилис может передаваться через плаценту (врожденный сифилис). Возбудитель первично локализуется в слизистых оболочках половых органов, ротовой полости, в коже. На месте внедрения в организм трепонемы размножаются и вызывают ряд пролиферативных и деструктивных изменений.

Различают три периода сифилиса.

Первичный сифилис развивается после инкубационного периода продолжительностью от 2 нед до 3 мес, обычно 21 - 24 дня. Он характеризуется образованием первичной сифиломы в виде плотного инфильтрата с поверхностной эрозией или язвой на месте внедрения трепонемы. Дно и края язвы имеют хрящеподобную консистенцию (откуда и названия ulcus durum, первичный склероз, твердый шанкр). Первичной сифиломе сопутствует возникновение регионариого аденита в виде увеличенных плотных лимфатических узлов. Продолжительность первой стадии болезни около 6 нед. Первичный сифилис подразделяют на серонегативный, серопозитивный и скрытый (lues latens).

При вторичном сифилисе наблюдаются высыпания на коже и слизистых оболочках, развитие специфических процессов во внутренних органах, в костной, периферической и центральной нервной системе. Продолжительность этого периода 2 - 3 года, иногда несколько лет. Вторичный сифилис может быть свежим, рецидивным и скрытым.

В третичном периоде в коже, подкожной клетчатке, внутренних органах и т. д. образуются папулы, бугорки, гуммы или гуммозные инфильтраты, склонные к распаду. Этот период продолжаетсянесколько лет. Третичный сифилис также может протекать в активной и скрытой формах.

В некоторых случаях через 9 - 10 лет наступает поражение центральной нервной системы (прогрессивный паралич) или спинного мозга (спинная сухотка, tabes dorsales), когда трепонемы в большом количестве локализуются в мозговой ткани, обусловливая глубокие органические и функциональные изменения центральной нервной системы. Этот период называют иногда четвертичным сифилисом.

С сифилисом сходен эндемический трепонематоз арабских стран под местным названием «беджель», вызываемый Тг. pallidum. В отличие от сифилиса беджель поражает кожу, слизистые оболочки и костную систему и передается бытовым путем. Болезнь широко распространена в сельской местности, преимущественно среди детей.

К трепонематозам относится фрамбезия (явс), возбудителем которой является Тг. pertenue. При фрамбезии поражаются кожные покровы; она встречается в тропических странах; передается внеполовым путем. Это типичная эндемическая социальная болезнь, которой болеет преимущественно местное население, живущее в тяжелых условиях.

Это встречается в тропических странах (Африка, Остров Цейлон, Южная Америка, Центральная Америка, Индия, Индокитай, Юг Китай, Индонезия, и Север Австралия). Болезнь главным образом воздействует на местное население, которое живет при трудных условиях(состояниях). frambesia - типичная социальная эндемическая болезнь. Сифилис и frambesia способны к созданию взаимного иммунитета

В Латинской и Центральной Америке, Западной Индии, иногда на Кубе встречается «пинта», которая вызывается Тг. carateum. Пинта - хроническое заболевание, сопровождающееся пигментацией кожи и выпадением волос.

Лечат эти болезни пенициллином пролонгированного действия, а также тетрапиклинами, хлорамфениколом.

Иммунитет. При сифилисе иммунитет существенно отличается по своему характеру от иммунитета при других заболеваниях. Болезнь не оставляет после себя невосприимчивости, выздоровевшие от болезни могут быть повторно инфицированы.

Иммунитет при сифилисе является инфекционным и характеризуется клеточными защитными реакциями (сенсибилизированные лимфоциты продуцируют липолитические ферменты, которые вызывают лизис трепонем). Присутствие антител не является показателем резистентности организма.

Болезнь сопровождается выработкой двух видов антител: неспецифических (реагинов) и специфических (противотрепонемных). Реагины продуцируются всеми больными сифилисом, но не обладают защитным действием, они вступают в реакцию in vitro с кардиолипиновьм антигеном, экстрагированным из мышц бычьего сердца. Специфические противотрепонемные антитела (IgG и IgM) вырабатываются под влиянием протеиновых антигенов бледной трепонемы.

Состояние инфекционной аллергии, специфическое проявление реактивности организма, является характерной особенностью сифилиса. В течение первичного сифилиса (твердого шанкра) реактивность снижена. Повышение реактивности встречается наиболее часто во время более поздних стадий и сопровождается глубокими изменениями в органах и тканях. Состояние аллергии может быть выявлено внутрикожной люэтиновой пробой. Люэтин получают из культур T. pallidum либо из пораженных тканей.

Лабораторная диагностика.

Сложность выращивания in vitro большинство патогенных трепонем наряду с транзиторным характером многих поражений делает невозможной диагностику трепонематозов обычными бактериологическими методами. Хотя спирохеты и обнаруживаются микроскопически при первичных и вторичных поражениях, но диагноз основывается прежде всего на клинических наблюдениях и подтверждается серологическими реакциями. Для практических целей серологический ответ ко всем трепонемам можно считать идентичным, поэтому мы рассмотрим здесь в основном применение серодиагностики сифилиса.

Прямая микроскопия.Трепонемы могут быть обнаружены непосредственно в свежем экссудате из первичных или вторичных сифилом при темно-польной или фазово-контрастной микроскопии. Во всех стадиях заболевания производят микроскопические исследования отделяемого язвы, эрозий, папул или пунктатов из регионарных лимфатических узлов. Хотя этот метод позволяет поставить быстрый и точный диагноз, но он может быть малочувствительным, так как первичные повреждения могут содержать относительно немного бактерий. Кроме того, необходимо проводить дифференциацию между патогенными и комменсальными спирохетами, которые могут контаминировать исследуемый материал. Бледную трепонему необходимо дифференцировать с непатогенными представителями этого рода, обитающими на наружных половых органах (Tr. refringens, Tr. phagedenis) и в полости рта (Tr. macrodentium, Tr. denticola, Tr. orale), которые значительно грубее и отличаются по характеру движения и количеству завитков. Более чувствительные и специфичные результаты могут быть получены при использовании фиксированного материала реакции иммунофлюоресценции с антитрепонемными антителами.

Серологические реакции. Инфекция T. pallidum приводит к образованию двух типов антител:

1. Специфические антитела, направленные прежде всего на полипептидные антигены трепонем.

2. Неспецифические антитела, которые реагируют с нетрепонемным кардиолипиновым антигеном.

Неспецифические серологические тесты на сифилис. Механизм индукции неспецифических антител остается неясным. Кардиолипин - фосфолипид, извлеченный из сердца быка, и возможно, что подобное вещество, имеющееся в клетке трепонемы или высвобождающееся из клеток хозяина, пораженных микроорганизмом, может стимулировать выработку антител.

Реакции на неспецифические антитела из-за их дешевизны и технической простоты обычно используются в качестве скрининг-тестов для выявления сифилитической инфекции. Так как эти тесты имеют относительно низкую специфичность, положительные результаты подтверждают обнаружением специфических антитрепонемных антител.

Реакция связывания комплемента, реакция Вассермана, предложенная в 1906 г., была первой серологической реакцией для диагностики сифилиса.

Реакция Вассермана до сих пор имеет значение в диагностике серопозитивного сифилиса в Украине. Реакция Вассермана сходна с реакцией связывания комплемента Борде - Жангу.

Реакция Вассермана в первичном периоде сифилиса бывает положительной в половине случаев, но не ранее чем через 2 - 3 нед после появления шанкра или на 5 - 6-й неделе от момента заражения; во вторичном периоде реакция Вассермана становится положительной у 90% больных, в третичном периоде - в среднем у 75%, преимущественно нелеченых или плохо леченных, при прогрессивном параличе - у 95 - 98% и при спинной сухотке - у 50 - 70% больных. У новорожденных и грудных детей, больных сифилисом, реакция Вассермана бывает отрицательной; у детей с врожденным сифилисом она становится положительной только через 2 - 3 мес после рождения.

Реакция Вассермана (в совокупности с клиническими данными и осадочными реакциями) служит методом контроля за качеством лечения. После лечения больных с первичным и вторичным серопозитивным сифилисом она становится отрицательной через 1 '/2 - 2 мес. При третичном сифилисе она может длительно (1 – I,5 года и более) оставаться положительной. Необходимо помнить, что отрицательная реакция Вассермана - не единственный критерий излечения от сифилиса.

Реакция Вассермана может быть положительной (неспецифической) при беременности, начиная с 8 мес, и после родов, при малярии, туберкулезе, некоторых вирусных и протозойных заболеваниях, лепре, пемфигусе, лептоспирозе, новообразованиях, во время менструации, после наркоза, употребления накануне взятия крови спиртных напитков, жирной пищи, лекарств, введения чужеродных сывороток и др.

Неспецифические положительные реакции Вассермана при повторных исследованиях, которые производят дву- или троекратно через 10 - 15 дней, становятся отрицательными; методом титрования сывороток можно дифференцировать ложноположительные и положительные реакции Вассермана.

При диагностике сифилиса используют осадочные реакции Кана и цитохолевую. Сыворотку смешивают со специальным липидным антигеном (спиртовой экстракт различных животных органов + холестерин). Положительная реакция проявляется формированием мелких гранул или хлопьев и отрицательного появлением (внешним видом) однородной мути, при отрицательной появляется равномерная муть.

Несмотря на огромную ценность реакции Вассермана прошлом, теперь она имеет главным образом исторический интерес. Всемирная Организация Здравоохранения (1982 г.) рекомендовала прекратить использование этой реакции.

Предпочтительным методом обнаружения антител к кардиолипину является тест Контрольной лаборатории венерических заболеваний (КЛВЗ - VDRL) или одна из его модификаций, так как он легко стандартизируется, прост и обладает хорошей воспроизводимостью. Все другие тесты, включая реакцию связывания комплемента, дают менее надежные результаты и в большинстве лабораторий были прекращены.

Тест Контрольной лаборатории венерических заболеваний (КЛВЗ).В своей оригинальной форме тест выполняется реакция на предметном стекле, в которой сыворотка пациента (3 объема), предварительно прогретая для инактивации комплемента, смешивается на предметном стекле со свежеприготовленной суспензией кардиолипин-лецитин-холесторолового антигена (1 объем). Смесь вращают, обычно механически, в течение 4 минут, после чего определяют под малым увеличением микроскопа флоккуляцию (аггрегацию комплексов антиген-антитело). Тест легко может быть выполнен в количественном варианте с последовательными разведениями исследуемой сыворотки, наибольшее разведение, дающее положительную реакцию, определяется как титр реакции. Основные недостатки теста КЛВЗ на предметном стекле – необходимость готовить свежий антиген каждый день и использовать микроскоп, чтобы учитывать результаты. Термоинактивация сыворотки необходима для разрушения термолабильного ингибитора IgM, который может находиться в нормальной и сифилитической сыворотке. Хотя это и рассматривалось как недостаток, температурная обработка в настоящее время одобрена многими лабораториями, так как она инактивирует ВИЧ.

Тест КЛВЗ используется в качестве скрининг-теста и положительна примерно у 70 % больных первичным и 99 % - вторичным сифилисом, но отрицательна при позднем сифилисе. Нарастание титра при количественном тесте КЛВЗ может использоваться для подтверждения диагноза врожденного сифилиса.

Так как положительный результат теста КЛВЗ обычно указывает на активную инфекцию, он может также использоваться для контроля за эффективностью антибактериальной терапии.