Метаболизм. Основные процессы клеточного метаболизма. Механизмы регуляции метаболитических процессов.

Целью любого биотехнологического производства является получение максимально возможного количества целевого продукта с единицы объема установки при минимально возможных затратах. На практике существует два основных пути решения этих задач, которые заключаются с одной стороны в создании новых штаммов микроорганизмов, обладающих повышенной продукционной способностью, т.е. способностью к синтезу того или иного целевого продукта, а с другой стороны в создании оптимальных условий для протекания в клетках интересующего нас метаболитического процесса.

Решение этих задач в той или иной степени связано с изменением регуляторных процессов в клетке, поэтому в настоящем разделе мы рассмотрим некоторые механизмы регуляции биохимической активности бактериальной клетки.

В нормально функционирующей живой клетке одномоментно протекает множество катализируемых ферментами химических реакций, приводящих к образованию огромного количества разнообразных соединений. В норме обмен веществ в клетке (метаболизм) осуществляется по принципам строжайшей экономии энергии и вещества, что обеспечивается сложнейшей системой регуляции обмена веществ.

Все процессы клеточного метаболизма можно условно разделить на две группы.

1. Процессы, в которых происходит разложение сложных веществ до более

простых с получением энергии называются катаболитическими, а промежуточные и конечные продукты – катаболитами.

2. Процессы, в которых происходит синтез сложных веществ из простых с потреблением энергии называются анаболитическими, а промежуточные и конечные продукты – анаболитами.

Между катаболитическими и анаболитическими процессами в клетке существует тесная взаимосвязь. Катаболитические процессы служат источником энергии и “строительного материала” для анаболитических процессов, а продукты анаболизма могут служить субстратом для катаболитичких процессов (питательные вещества) или выполнять функции катализаторов (белки-ферменты).

Самый простой способ регуляции любого метаболического пути основывается на доступности субстрата. Действительно, в соответствии с законом действия масс, снижение количества субстрата-реагента (его концентрации в среде) приводит к снижению скорости протекания процесса (реакции) через данный метаболический путь. С другой стороны, повышение концентрации субстрата приводит к стимулированию этого метаболического пути. Поэтому, независимо от каких-то иных факторов, наличие (доступность) субстрата является важнейшим механизмом интенсификации любого метаболического процесса. Иногда эффективным средством повышения выхода целевого продукта является увеличение концентрации в клетке какого-либо определенного предшественника. Однако, в отличие от химических процессов, в биотехнологии данный путь имеет свои ограничения, т.к. высокие концентрации субстратов (больше 3-5%), например глюкозы или сахарозы, обычно резко тормозят рост микроорганизмов, что используется, например, для консервирования ягод и фруктов. Связано это, прежде всего с осмотическим эффектом, который вызывается большой разностью в концентрации этих веществ внутри клеток и в окружающей среде.

Однако в клетках имеется на много порядков более эффективный механизм контроля метаболитических процессов, основанный на регуляции ферментативного аппарата клетки. Такая регуляция может осуществляться по крайней мере двумя путями. Один из них очень быстрый (реализующийся в течение секунд или минут) заключается в изменении каталитической активности уже имеющихся молекул фермента. Второй, более медленный (реализуется в течение многих минут), состоит в изменении скоростей синтеза (количества) ферментов. В обоих механизмах используется единый принцип управления системами – принцип обратной связи.

Поскольку все процессы протекающие в клетке требуют участия специфических белковых катализаторов – ферментов,то общее количество ферментов в клетках может варьироваться от нескольких десятков до нескольких сотен, а процентная доля их по отношению к другим клеточным белкам будет достаточно большой (до нескольких процентов даже для одного фермента).

Однако энергетических (АТФ) и сырьевых ресурсов клетки (аминокислот) не хватает для одновременного синтеза всех необходимых ферментов. Поэтому постоянно синтезируются только те ферменты, которые поддерживают основные клеточные функции (например ферменты гликолиза, ЦТК). Такие ферменты называют конститутивными. Другие ферменты, адаптивные или индуцибельные, синтезируются только в ответ на появление каких то внешних факторов или веществ – индукторов,которые являются субстратами (питательными веществами ) или их аналогами.

Уровень синтеза таких ферментов регулируется двумя механизмами – индукцией и репрессией.

Под индукцией понимают относительное увеличение синтеза одного фермента или группы ферментов, участвующее в одной и той же последова-тельности реакций, например в разложении какого-то сложного вещества до более простых. Ферменты, синтез которых регулируется таким образом, называют адаптивными или индуцированными (индуцибельными), а субстраты, вызывающие их синтез - индукторами. Под влиянием индукторов количество адаптив­ных ферментов может возрастать в сотни раз. Так, для E.coliуста­новлено, что у культуры, выросшей на среде с глюкозой, обнаруживает лишь следы β-галактозидазы, осуществляющей реакцию расщепления лактозы до α-галактозы и D-глюкозы. При перенесении культуры на среду с лактозой, уже через несколько минут, начинается активный синтез β-галактозидазы и у адаптированной культуры до 3% от содержания белка приходится на этот фермент.

Для индуцируемых ферментов установлено, что:

а) фермент появляется во всех клетках одновременно и это нельзя объяснить мутациями;

б) индуцированный фермент целиком синтезируется в клетке из аминокислот или, как говорят, образуется de novo (изначально).

в) фермент синтезируется до тех пор, пока в среде есть индуктор. Через индукцию регулируется синтез ферментов, участвующих в катаболических процессах, т.е. индуцируемые ферменты необходимы для пог­лощения клеткой субстратов и включения их в обмен.

При промышленном получении ферментов, часто великолепными индукторами являются неутилизируемые структурные аналоги субстратов. Например, для β-галактозидазы таким веществом служит изопропил-β – D-тио-галактопиранозид (ИПТГ) неметаболизируемый аналог лактозы. Это позволяет увеличить выход фермента, который при этом не расходуется в ферментативной реакции и облегчить его очистку т.к. ИПТГ берется в количестве значительно меньшем, чем лактоза и в культуральной жидкости нет продуктов ее распада.

Вторым механизмом регуляции синтеза ферментов является репрес­сия, когда наблюдается относительное уменьшение синтеза фермента или группы ферментов, участвующих в одной и той же последователь­ности реакций, В зависимости от природы репрессоров различают реп­рессию конечным продуктом и репрессию катаболитами. Репрессия конечным продуктом наблюдается только для ферментов, осуществлявших анаболические реакции. При наличии в клетке конечного продукта ана­болического пути снижается скорость синтеза всех ферментов, участ­вующих в его образовании. Этот процесс позволяет экономить клеточ­ный белок, останавливая синтез тех ферментов, которые в данный мо­мент не требуются клетке.

Репрессия катаболитами характерна для реакций разложения сложных органических веществ микроорганизмами. Этот механизм позволяет клетке использовать более доступный субстрат, обеспечивавший высо­кую скорость роста культуры. Предпочтение отдается тем субстратам, разложение которых включает меньшее число стадий: микроорганизмы предпочитают простые сахара сложным, аминокислоты - пептидам и т.д. Одним из примеров катаболитной репрессии является “глюкозный эф­фект" - явление, наблюдаемое при выращи-вании микроорганизмов на средах, содержащих наряду с глюкозой другие источники углерода. Глюкоза, как наиболее легко усвояемый субстрат, метаболизируется в клетке и продукты ее разложения тормозят синтез ферментов, участвующих в усвоении более сложных субстратов до тех пор, пока не будет использована вся глюкоза.

Регуляция обмена веществ микробной клетки может происходить также путем изменения ферментативной активности имеющихся ферментов. Это явление наблюдается преимущественно в анаболитических процессах. Наиболее изученным механизмом является ингибирование активности ферментов конечным продуктом (ретроингибирование), когда активность фермента, стоящего в начале многоступенчатого превращения субстрата тормозится конечным метаболитом.

Впервые о наличии такого регуляторного механизма было сообщено в 1953 г. При изучении биосинтеза триптофана клетками E.coli. Заключительный этап биосинтеза данной ароматической аминокислоты состоит из нескольких, катализируемых индивидуальными ферментами стадий. Было обнаружено, что у одного из мутантов E. coli с нарушенным биосинтезом триптофана добавление данной аминокислоты (являющейся конечным продуктом этого биосинтетического пути) резко тормозит накопление одного из предшественников – индол глицерофосфата в клетках. Уже тогда было высказано предположение, что триптофан ингибирует активность какого-то фермента, катализирующего образование индол глицерофосфата. Несколько позднее было четко установлено, что таким чувствительным к триптофану ферментом является антранилатсинтетаза, которая катализирует более раннюю реакцию триптофанового пути – образование антраниловой кислоты из хоризмовой кислоты и глутамина. Этот факт был экспериментально обоснован в опыте, когда добавление триптофана в клеточные экстракты E. coli, содержащие фермент антранилатсинтетазу и его субстраты (хоризмат и глутамин), приводило к резкому ингибированию образования антранилата. Более того, было однозначно продемонстрировано, что активность антранилатсинтетазы подавляется только триптофаном и никакие другие метаболиты клетки подобного действия не оказывают.

Благодаря этому явлению у микроорганизмов предотвращается перепроизводство низкомолекулярных промежуточных продуктов обмена, таких, как аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды. Как правило, субстрат ингибируемого фермента резко отличается от конечного продукта - ингибитора и это обстоятельство позволяет считать, что конечный продукт соединяется не с активным центром фермента, а со специальным регуляторным или аллостерическим (от греч. «аллос» – другой, «стерос» – пространственный), центром. Присоединение конечного продукта к аллостерическому центру фермента сопровождается утратой нормальной каталитической активности вследствии конформационных изменений структуры белковой молекулы.

По сравнению с индукцией и репрессией ретроингибирование это инструмент быстрого и точного регулирования метаболитических процессов.

Ретроингибирование является крайне нежелательным явлением при промышленном получении тех или иных интересующих человека клеточных метаболитов, т.к. препятствует их накоплению в высоких концентрациях, что требует использования установок большего объема и усложняет процесс их выделения и очистки. А это в свою очередь увеличивает себестоимость продукции. Существует несколько подходов, позволяющих снять или значительно уменьшить эффект ретроингибирования. Один из них состоит в том, что целевой продукт (ингибитор), удаляют. Например, если он является эндометаболитом, то создаются условия для его ухода из клетки в культуральную жидкость, например за счет повышения проницаемости клеточных оболочек. Если целевой продукт является экзометаболитом (аминокислоты, антибиотики), то его удаляют из культуральной жидкости, например, переводя в нерастворимое состояние (осадок). Второй подход состоит в том, что на стадии синтеза продукта в культуральную жидкость добавляют вещество-промежуточный метаболит, синтез которого блокируется конечным продуктом (см. синтез триптофана). Недостатком этого подхода является то, что такой предшественник не всегда может быть получен дешево и в больших количествах. На практике, если возможно, обычно применяют оба подхода.

Другие подходы связаны с использованием методов мутагенеза-селекции и генной инженерии. Например, при мутационном изменении аллостерического центра (центра взаимодействия с ингибитором) чувствительность к ингибитору утрачивается и фермент сохраняет свою активность при высоких концентрациях конечного продукта, что позволяет создать более высокопродуктивные штаммы микроорганизмов-продуцентов. Более сложный вариант данного подхода реализуется при микробиологическом получении лизина (см. синтез лизина).