Приготовление концентрирующего геля
После окончания полимеризации воду или изобутанол сливают и промывают верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и изобутанола, если он использовался. Сливают с верхней части геля так много жидкости, как только возможно и затем удаляют любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой.
В конической колбе готовят соответствующее количество раствора, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в табл. 2. Смешивают компоненты в том же порядке и с использованием тех же приемов фильтрации и дегазирования, что и для разделяющего геля. После добавления соответствующих количеств раствора аммония персульфата и TEMED, как указано в табл.2, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляют чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляют избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.
Таблица 1 – Приготовление разделяющего геля
| Компоненты раствора | Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема | |||||||
| 5 мл | 10 мл | 15 мл | 20 мл | 25 мл | 30 мл | 40 мл | 50 мл | |
| 4% акриламида | ||||||||
| Вода очищенная | 2,6 | 5,3 | 7,9 | 10,6 | 13,2 | 15,9 | 21,2 | 26,6 |
| Раствор акриламида1) | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 6,0 | 8,0 | 10,0 |
| 1,5М Трис (рН 8,8)2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 г/л SDS3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 г/л APS4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED5) | 0,004 | 0,008 | 0,012 | 0,016 | 0,02 | 0,024 | 0,032 | 0,04 |
| 8% акриламида | ||||||||
| Вода очищенная | 2,3 | 4,6 | 6,9 | 9,3 | 11,5 | 13,9 | 18,5 | 23,2 |
| Раствор акриламида1) | 1,3 | 2,7 | 4,0 | 5,3 | 6,7 | 8,0 | 10,7 | 13,3 |
| 1,5М Трис (рН 8,8)2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 г/л SDS3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 г/л APS4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED5) | 0,003 | 0,006 | 0,009 | 0,012 | 0,015 | 0,018 | 0,024 | 0,03 |
| 10% акриламида | ||||||||
| Вода очищенная | 1,9 | 4,0 | 5,9 | 7,9 | 9,9 | 11,9 | 15,9 | 19,8 |
| Раствор акриламида1) | 1,7 | 3,3 | 5,0 | 6,7 | 8,3 | 10,0 | 13,3 | 16,7 |
| 1,5М Трис (рН 8,8)2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 г/л SDS3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 г/л APS4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED5 | 0,002 | 0,004 | 0,006 | 0,008 | 0,01 | 0,012 | 0,016 | 0,02 |
| 12% акриламида | ||||||||
| Вода очищенная | 1,6 | 3,3 | 4,9 | 6,6 | 8,2 | 9,9 | 13,2 | 16,5 |
| Раствор акриламида1) | 2,0 | 4,0 | 6,0 | 8,0 | 10,0 | 12,0 | 16,0 | 20,0 |
| 1,5М Трис (рН 8,8)2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 г/л SDS3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 г/л APS4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED5) | 0,002 | 0,004 | 0,006 | 0,008 | 0,01 | 0,012 | 0,016 | 0,02 |
| 14% акриламида | ||||||||
| Вода очищенная | 1,4 | 2,7 | 3,9 | 5,3 | 6,6 | 8,0 | 10,6 | 13,8 |
| Раствор акриламида1) | 2,3 | 4,6 | 7,0 | 9,3 | 11,6 | 13,9 | 18,6 | 23,2 |
| 1,5 М Трис (рН 8,8)2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 г/л SDS3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 г/л APS4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED5) | 0,002 | 0,004 | 0,006 | 0,008 | 0,01 | 0,012 | 0,016 | 0,02 |
| 15% акриламида | ||||||||
| Вода очищенная | 1,1 | 2,3 | 3,4 | 4,6 | 5,7 | 6,9 | 9,2 | 11,5 |
| Раствор акриламида1) | 2,5 | 5,0 | 7,5 | 10,0 | 12,5 | 15,0 | 20,0 | 25,0 |
| 1,5М Трис (рН 8,8)2) | 1,3 | 2,5 | 3,8 | 5,0 | 6,3 | 7,5 | 10,0 | 12,5 |
| 100 г/л SDS3) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| 100 г/л APS4) | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,4 | 0,5 |
| TEMED5) | 0,002 | 0,004 | 0,006 | 0,008 | 0,01 | 0,012 | 0,016 | 0,02 |
Таблица 2 – Приготовление концентрирующего геля
| Компоненты раствора | Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема | |||||||
| 1 мл | 2 мл | 3 мл | 4 мл | 5 мл | 6 мл | 8 мл | 10 мл | |
| Вода очищенная | 0,68 | 1,4 | 2,1 | 2,7 | 3,4 | 4,1 | 5,5 | 6,8 |
| Раствор акриламида1) | 0,17 | 0,33 | 0,5 | 0,67 | 0,83 | 1,0 | 1,3 | 1,7 |
| 1,0М Трис (рН 6,8)6) | 0,13 | 0,25 | 0,38 | 0,5 | 0,63 | 0,75 | 1,0 | 1,25 |
| 100 г/л SDS3) | 0,01 | 0,02 | 0,03 | 0,04 | 0,05 | 0,06 | 0,08 | 0,1 |
| 100 г/л APS4) | 0,01 | 0,02 | 0,03 | 0,04 | 0,05 | 0,06 | 0,08 | 0,1 |
| TEMED5) | 0,001 | 0,002 | 0,003 | 0,004 | 0,005 | 0,006 | 0,008 | 0,01 |
1) Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1)
2) 1,5М Трис (рН 8,8): 1,5 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 8,8
3) 100 г/л SDS: раствор натрия додецилсульфата 100 г/л
4) 100 г/л APS: раствор аммония персульфата 100 г/л. Аммония персульфат является источником свободных радикалов, которые управляют полимеризацией акриламида и бисакриламида. Таким образом, раствор аммония персульфата должен добавляться медленно.
5) TEMED: тетраметилэтилендиамин.
6) 1,0М Трис (рН 6,8): 1 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 6,8
Гель со вставленной гребенкой оставляют в вертикальном положении при комнатной температуре до окончания полимеризации.
Если в фармакопейной статье нет других указаний, то определение молекулярных масс проводят при нагрузке на лунку 10 мкг общего белка, а определение чистоты – при нагрузке 40 мкг при окрашивании Кумасси бриллиантовым R250, а при окрашивании нитратом серебра достаточно 2–5 мкг белка на лунку.
Толщина гребенки выбирается точно в соответствии с толщиной используемых прокладок, а размер зубцов – в соответствии с предполагаемым объемом образцов. Необходимый и достаточный объем формируемой лунки определяется как произведение длины, ширины и высоты (в микрометрах) одного зубца гребенки: V = L ∙ D ∙ H.
Объем наносимого образца вычисляют следующим образом:
Vx = k ∙ Х/C,
где: k – коэффициент разбавления пробы буферным раствором для образца;
Х – требуемое для нанесения на гель количество белка в зависимости от целей анализа, в мкг;
С – концентрация общего белка, определяемая по методу Лоури, в мкг/мл.
Дата добавления: 2016-01-30; просмотров: 808;