Приготовление концентрирующего геля

После окончания полимеризации воду или изобутанол сливают и промывают верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и изобутанола, если он использовался. Сливают с верхней части геля так много жидкости, как только возможно и затем удаляют любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой.

В конической колбе готовят соответствующее количество раствора, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в табл. 2. Смешивают компоненты в том же порядке и с использованием тех же приемов фильтрации и дегазирования, что и для разделяющего геля. После добавления соответствующих количеств раствора аммония персульфата и TEMED, как указано в табл.2, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляют чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляют избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.

Таблица 1 – Приготовление разделяющего геля

Компоненты раствора Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема
5 мл 10 мл 15 мл 20 мл 25 мл 30 мл 40 мл 50 мл
4% акриламида                
Вода очищенная 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,6
Раствор акриламида1) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0
1,5М Трис (рН 8,8)2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
100 г/л SDS3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
100 г/л APS4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED5) 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04
8% акриламида                
Вода очищенная 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2
Раствор акриламида1) 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3
1,5М Трис (рН 8,8)2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
100 г/л SDS3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
100 г/л APS4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED5) 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03
10% акриламида                
Вода очищенная 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8
Раствор акриламида1) 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7
1,5М Трис (рН 8,8)2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
100 г/л SDS3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
100 г/л APS4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED5 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
12% акриламида                
Вода очищенная 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5
Раствор акриламида1) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0
1,5М Трис (рН 8,8)2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
100 г/л SDS3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
100 г/л APS4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
14% акриламида                
Вода очищенная 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8
Раствор акриламида1) 2,3 4,6 7,0 9,3 11,6 13,9 18,6 23,2
1,5 М Трис (рН 8,8)2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
100 г/л SDS3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
100 г/л APS4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
15% акриламида                
Вода очищенная 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5
Раствор акриламида1) 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0
1,5М Трис (рН 8,8)2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
100 г/л SDS3) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
100 г/л APS4) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

 

Таблица 2 – Приготовление концентрирующего геля

Компоненты раствора Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема
1 мл 2 мл 3 мл 4 мл 5 мл 6 мл 8 мл 10 мл
Вода очищенная 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8
Раствор акриламида1) 0,17 0,33 0,5 0,67 0,83 1,0 1,3 1,7
1,0М Трис (рН 6,8)6) 0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25
100 г/л SDS3) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1
100 г/л APS4) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1
TEMED5) 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01

1) Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1)

2) 1,5М Трис (рН 8,8): 1,5 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 8,8

3) 100 г/л SDS: раствор натрия додецилсульфата 100 г/л

4) 100 г/л APS: раствор аммония персульфата 100 г/л. Аммония персульфат является источником свободных радикалов, которые управляют полимеризацией акриламида и бисакриламида. Таким образом, раствор аммония персульфата должен добавляться медленно.

5) TEMED: тетраметилэтилендиамин.

6) 1,0М Трис (рН 6,8): 1 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 6,8

 

Гель со вставленной гребенкой оставляют в вертикальном положении при комнатной температуре до окончания полимеризации.

Если в фармакопейной статье нет других указаний, то определение молекулярных масс проводят при нагрузке на лунку 10 мкг общего белка, а определение чистоты – при нагрузке 40 мкг при окрашивании Кумасси бриллиантовым R250, а при окрашивании нитратом серебра достаточно 2–5 мкг белка на лунку.

Толщина гребенки выбирается точно в соответствии с толщиной используемых прокладок, а размер зубцов – в соответствии с предполагаемым объемом образцов. Необходимый и достаточный объем формируемой лунки определяется как произведение длины, ширины и высоты (в микрометрах) одного зубца гребенки: V = LDH.

Объем наносимого образца вычисляют следующим образом:

Vx = k Х/C,

где: k – коэффициент разбавления пробы буферным раствором для образца;

Х – требуемое для нанесения на гель количество белка в зависимости от целей анализа, в мкг;

С – концентрация общего белка, определяемая по методу Лоури, в мкг/мл.








Дата добавления: 2016-01-30; просмотров: 799;


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам перенёс пользу информационный материал, или помог в учебе – поделитесь этим сайтом с друзьями и знакомыми.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2024 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.012 сек.