Экспрессии чужеродных генов

Одним из наиболее значимых достижений генетической инженерии является клонирование эукариотических генов, что дает возможность осуществлять синтез микробными клетками важнейших для народного хозяйства белков — ферментов, гормонов, иммуномодуляторов и др. Эукариотические организмы-доноры генетического материала характеризуются гораздо менее высоким уровнем продукции природных белков, чем генноинженерные штаммы-продуценты. Поэтому получение практически ценных белков для изучения их структуры и свойств, а также для использования в хозяйственных целях осуществляют чаще с использованием гибридных микробных штаммов, а не культур клеток растений и животных или их органов и тканей. Названным способом получены такие ценные белки, как гормон роста человека и некоторых животных, инсулин, фактор роста эпидермиса человека, фактор некроза опухолей человека и мыши, a-, b- и g-интерфероны, медиатор нервной системы соматостатин, гормон кальцитонин, миоглобин, гормоноподобные сигнальные белки интерлейкины, фактор свертывания крови, отсутствующий у больных гемофилией, обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей, урокиназа, трипсин, некоторые онкобелки, вакцины против некоторых вирусов и др.

Когда ген в составе векторной молекулы переносится из клеток одного организма в клетки другого, возникают проблемы с его экспрессией—транскрипция и трансляция мРНК могут не осуществляться вовсе либо происходить с низкой частотой. Это является следствием специфичности ферментов, катализирующих процессы транскрипции и трансляции, к определенным последовательностям ДНК (мРНК), структура которых бывает уникальной у различных таксономических групп организмов. Чаще всего проблемы экспрессии наблюдаются при клонировании эукариотических генов в клетках прокариот, в частности потому, что сигналы инициации транскрипции высших эукариот не распознаются РНК-полимеразами бактерий.

Для достижения эффективной экспрессии клонированных генов используют несколько подходов: 1) увеличение числа копий гена в клетке (амплификация гена); 2) подстановку перед структурной частью чужеродного гена сильного промотора, распознаваемого РНК-полимеразой клетки-хозяина; 3) подстановку перед геном чужеродного белка регуляторного элемента, обеспечивающего эффективную инициацию трансляции; 4) стабилизацию образующейся мРНК и белкового продукта. Перечисленные методы достижения высокого уровня экспрессии генов наилучшим образом разработаны для бактерий E.coli. Поскольку наличие такой методологии является определяющим условием конструирования новых продуцентов, кишечная палочка рассматривается как один из самых перспективных организмов, используемых для этой цели.

Амплификация генов. Для усиления экспрессии генов можно увеличить их количество в клетке. Осуществляют это двумя способами: увеличивая число копий рекомбинантных плазмид или увеличивая число копий гена в составе плазмиды.

Наиболее прост первый способ. Уже указывалось, что для конструирования векторов предпочтительнее использовать мультикопийные плазмиды, находящиеся под нестрогим контролем репликации. В этом случае число копий плазмид составляет 10—200. Данный показатель можно увеличить до нескольких тысяч, если подавить синтез белков бактериальной клетки или использовать мутантные плазмиды. Применение таких векторов позволяет значительно увеличить дозу целевого гена, а значит, и выход белкового продукта. Следует, однако, учитывать, что чрезмерная амплификация плазмид может приводить к снижению жизнеспособности штамма-продуцента из-за высокой токсичности некоторых чужеродных белков для бактерий, а также из-за увеличения времени генерации клеток.

Копийность генов в составе векторных молекул обеспечивают, создавая опероны с повторяющимися идентичными цистронами чужеродных генов. Сочетание перечисленных методов позволяет повысить дозу гена в клетке от нескольких десятков до тысяч копий на нуклеоид и увеличить уровень синтеза соответствующих белков (в ряде случаев на 1—2 порядка).

Достижение высокого уровня транскрипции чужеродных генов. Для того чтобы эукариотические гены транскрибировались в прокариотических клетках, их обычно подставляют под контроль сильных промоторов (обеспечивают высокую частоту событий инициации транскрипции) прокариот.

Наиболее часто для этих целей используют сильные промоторы кишечной палочки: лактозного оперона — PlacUV5, триптофанового — Ptrp; гибридные промоторы, например Ptrp-lacUV5 (Ptac), а также промоторы фага λ— PR, PL идругих фагов (Т5, Т7, jХ174). Выделение этих промоторов и включение их в состав векторов осуществляют в ходе генно-инженерных манипуляций.

Еще более совершенной является методология использования регулируемых промоторов, которые инициируют процесс эффективной транскрипции лишь в определенных условиях. Такими промоторами являются, например, PR и PL фага λ. Их используют в клетках, содержащих температурочувствительный сI-репрессор, ген которого может быть расположен на векторе или совместимой с ним плазмиде. В таких клетках экспрессия чужеродного гена под контролем PR или PL будет происходить лишь после инактивации репрессора повышением температуры ферментации.

Использование прокариотических регуляторных элементов, расположенных на многокопийных плазмидах, позволяет достигать уровня синтеза мРНК чужеродного гена до 25% от всей РНК бактериальной клетки.

Достижение высокого уровня трансляции чужеродных генов. Еще одним условием эффективной экспрессии клонированных генов является наличие перед геном чужеродного белка оптимального сайта инициации трансляции мРНК. На частоту событий трансляции первостепенное значение оказывает структура участков мРНК, обеспечивающих ее связывание с рибосомой и тРНК. Показано, что олигонуклеотидная последовательность, расположенная на 5’-конце и непосредственно примыкающая к стартовому кодону, обеспечивает комплементарное спаривание с нуклеотидами антикодоновой петли тРНК. В то же время среди нуклеотидов мРНК, участвующих во взаимодействии с рибосомой, достоверно установлена роль пуринбогатого участка на расстоянии 3— 15 нуклеотидов от стартового кодона (последовательность Шайн—Дальгарно, или SD-последовательность). Длина SD-последовательности, а также ее расположение относительно стартового кодона существенно сказываются на связывании рибосом с мРНК, а значит, и на частоте событий инициации трансляции.

Известно три основных подхода к конструированию векторов, обеспечивающих трансляцию чужеродной ДНК в бактериальных клетках. Одним из наиболее распространенных является метод конструирования «гибридных участков связывания рибосом». Суть его заключается в том, что структурная часть чужеродного гена (с собственным стартовым кодоном и несколькими нуклеотидами перед ним) включается между последовательностью SD и стартовым кодоном прокариотического гена. Такой метод имеет преимущество, состоящее в образовании полноразмерного чужеродного белка. Однако существенным недостатком метода является трудность достижения оптимального удаления стартового кодона от SD-последовательности, что, как указывалось, очень существенно для инициации трансляции. Поэтому применяют другой подход, в котором чужеродный структурный ген, лишенный собственных регуляторных областей, внедряют в состав хорошо экспрессируемого бактериального гена. Для этих целей чаще всего используют lac-промотор с соответствующей последовательностью Шайна—Дальгарно. Сайт внедрения должен быть достаточно удален от места инициации трансляции, чтобы новая нуклеотидная последовательность не мешала эффективной инициации транскрипции и трансляции бактериального гена. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором N-концевая часть представлена аминокислотами прокариотического пептида. Поэтому для выделения эукариотической полипептидной цепи требуется дополнительная химическая или ферментативная обработка.

Наконец, третий подход к конструированию векторов, обеспечивающих эффективную трансляцию, использует принцип «перекрывания» генов. В этом случае чужеродный ген встраивают в концевую часть прокариотического гена таким образом, что SD-последовательность второго гена расположена непосредственно в кодирующей области первого. При этом терминирующий трансляцию кодон первого гена является частью инициирующего кодона второго гена. Этот метод разработан в 1985 г. в СССР. Он позволяет достигать 100%-ной инициации трансляции второго гена, поскольку рибосомы, транслировавшие первую часть полицистронной мРНК, не отсоединяются от нее, а происходит реинициация трансляции второго гена. Таким образом, примене ние векторов с частично перекрывающимися генами в оперонах позволяет обеспечить эффективность инициации трансляции чужеродного гена не ниже, чем у исходного прокариотического цистрона.

Стабилизация мРНК и белкового продукта чужеродного гена. Стабильность мРНК в клетках бактерий можно повысить введением мутаций, инактивирующих РНКазы. Кроме этого, на стабильность мРНК влияет полинуклеотидфосфорилаза (pnp). Известны мутанты E.coli по генам pnp, в которых время полужизни мРНК, определяющей чужеродные белки, увеличивается в 1,5 раза.

Серьезным препятствием при получении штаммов-сверхпродуцентов может стать протеолиз чужеродных белков в клетке. Ведь набор клеточных пептидаз как раз и предназначен в основном для быстрой деградации полипептидов с «аномальной» структурой, которые возникают, например, в результате ошибок трансляции. Для стабилизации чужеродных белков можно использовать в качестве реципиентов штаммы, дефектные по системе деградации белков (lon-, htpR или deg-мутанты). Можно также вводить в бактериальную клетку ген pin бактериофага Т4, который контролирует синтез ингибиторов протеиназ, или другие гены с похожими функциями.

 








Дата добавления: 2015-09-29; просмотров: 2495;


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам перенёс пользу информационный материал, или помог в учебе – поделитесь этим сайтом с друзьями и знакомыми.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2024 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.004 сек.