Структура ДНК-полімерази й полімеразна реакція

Структуру основної частини ДНК-полімерази І – так званий фрагмент Кленова (Hans Klenow) – показано на рис. 5 (додатковий домен полімерази відповідає за 5′-екзонуклеазну активність).

Рис. 5. Комплекс фрагмента Кленова ДНК-полімерази І із ДНК у полімеразному активному центрі (1L3T).

Подібну структуру мають більшість інших про- та еукаріотичних ДНК-полімераз. Полімеразний активний центр розташований у межах долоні (palm) – щілини, яка оточена двома характерними структурними доменами: рухливими пальцями (fingers) і великим пальцем (thumb). Великий палець взаємодіє з маленьким жолобком подвійної спіралі, утвореної матричним ланцюгом і таким, що синтезується. Пальці взаємодіють із матричним ланцюгом, який при цьому трохи вигинається навкруг пальців, експонуючи чергову азотисту основу для взаємодії з NTP. Сайт зв’язування NTP утворюється пальцями, залишками активного центру, нуклеотидом матричного ланцюга та 3′-кінцем ланцюга, що синтезується. Рухливість пальців дозволяє їм існувати у двох конформаціях:

• Відкрита передбачає рух полімерази вздовж ДНК і швидкий перебір NTP.

• Закрита, коли пальці переміщуються в напрямку до великого пальця, жорстко фіксуючи NTP у активному центрі та забезпечуючи каталіз полімеразної реакції.

Полімеразна реакція (рис. 6) передбачає, що ДНК-полімераза має розташувати 3′-кінцеву ОН-групу зростаючого ланцюга в активному центрі, зв’язати NTP, за умови його комплементарності до нуклеотиду матричного ланцюга здійснити каталіз синтезу фосфодіефірного зв’язку з одночасним відщепленням пірофосфату.

Рис. 6. Схема ДНК-полімеразної реакції.

На першій стадії елонгаційного циклу відбувається зв’язування NTP (рис. 7). ДНК-полімераза при цьому реалізує свою відкриту конформацію, яка дозволяє швидку асоціацію / дисоціацію різних нуклеотидів. Якщо нуклеотид виявляється комплементарним матриці, з парою основ реалізуються численні взаємодії активного центрута його оточення. Це індукує конформаційну зміну в полімеразі (найповільніша лімітуюча стадія циклу) із переміщення пальців, наслідком чого є фіксація NTP у активному центрі (рис. 8) і нерухомість полімерази відносно ДНК. На третій стадії здійснюється каталіз реакції. Після приєднання нуклеотиду відбувається дисоціація пірофосфату й розмикання полімерази. Оскільки утворився новий продовжений 3′-кінець, який має спорідненість до активного центру, на останній стадії здійснюється транслокація – переміщення полімерази в її відкритій формі на один нуклеотид уздовж матриці.

Рис. 7. Елонгаційний цикл ДНКполімерази.

Рис. 8. Нуклеозидтрифосфат (СТР) та іон Mg²⁺ (фіолетовий) в активному центрі ДНК-полімерази (1LV5). Матричний ланцюг синій, зростаючий – червоний.

Принципова схема елонгаційного циклу ДНК-полімерази практично не відрізняється від такої РНК-полімерази. Механізм каталізу ДНК-полімеразної реакції також є цілком аналогічним: ключову роль у каталізі виконують два іони Mg²⁺, що утримуються в активному центрі трьома залишками Asp.