Uu J. W., W. H. Yap, T. Thanabalu, A. G. Porter.

1996. Efficient synthesis of mosquitocidal toxins in Asticcacaulis excentricus demonstrates potential of gramnegative bacteria in mosquito control, Nat. Biotechnoi 14:343-347.

Maeda S. 1995. Further development of recnmbi-nant baculoviniK insecticides. Curr. Opln. Biotechnoi. 6:313-319.

McCutchen B, F., P. V.Choudarj, IÎ. Crenshaw,

D. Maddox, S. G. Kamita, N. Palekar, S. Vclrath,

E. Fowler, B, D. Hammock, S. Maeda.1991. Development of a recombinant baculovirus expressing an insect-selective neurotoxin: potential for pest control. Bio/Technology 9: 848-852.

MettusA. M., A. Macafuso. 1990 Expression of Bacillus thuringiensis й-endntoxin genes during vegetative growth. Appl. Environ. Microbiol. 56: 1128-1134.

Murphy R. C., E. S. Stevens.1991. Cloning and expression of the crylVD gene of Bacillus thuringiensi!, suhsp. Kraelenxis m the cyanobac-• .im Л, -ut 'uin νιΐί>··ΙηψΙΐ(·, tut Ά Ί ;-mu i:.'. resulting larvicidal activity, Appl. Environ. Microbiol. 58: 1650 1655.

Otxikowic/ M. ti., F. J. Perlak, K. Kusaiio-Kretymer, E. J. Mayer, S. L· Bolten, L· S. Watrud. 1986. Tn5-mediated integration of the delta-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis into the chromosome of root-colonizing pseudomonads. J. Bacterial. 168: 982-989.

Obukowicz M. G., F. J. Perlak, K. Kusano-Kretzmer, E. J. Mayer, L. S. Watrud. 1986. Integration of the delta-endotoxin gene of Bacillus ihuringiensis into the chromosome of root-colonizing strains of pseudomonads using Tn5. Gene 45: 327-33).

Priest F. G. 1992. Biological control of mosquitoes and other biting flies by Bacillus .sphaericus and Bacillus thuringiensls. J. Appl. Bacterial. 72: 357-369.

Schnepf H. E._f H. R. Whiteley. 1981. Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli. Proc. Natt. Acad. Sei. USA 78: 2893-2897.

Stewart L. M. D., M. Hisrt, M. L. Ferber, A. T. Merryweather, P. J. Cayley, R, D. Possee. 1991. Construction of an improved baculovirus insecticide containing an insect-specific toxin gene. Nature 352: 85-88.

Thanabalu T., J. Hindley, S. Brenner, C. Oei, C. Berry. 1992. Expression of the mosquitocidal toxins of Bacillus sphaericus and Bacillus Ihuringiensis subsp. israelensis by recombinant Caulobacter crescentus, & vehicle for biological control of aquatic insect larvae. Appl. Environ. Microbiol. 58:905-910.

Thiery I., L. Nicholas, R. Kippka, N. Tandeau de Marsac. 1991. Selection of cyanobacteria isolated from mosquito breeding sites as a potential food source for mosquito larvae. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1354-1359.

Tomalski M. D., L. K. M U 1er. 1991. Insect paralysis by baculovirus-mediated expression of a mite neurotoxin gene. Nature 352: 82 -84.

Van Rie J., W. H. McGaughey, D. E. Johnson, B. I). Harriett, H. Van Mdlaert. 1990. Mechanism of inscel resistiinee of the microbial inscelieide Bacillus thuringiensis. Science 247: 72—74.

Wood Η. Α., R. R. Granados. 1991. Genetically engineered baculoviruses as agents fbr pest control. Annu. Rev. Microbiol. 45: 69-87.

Yap W. H., T. Thanabalu, A. G. Porter. 1994. Expression of mosquitocidal toxin genes in a gas vacuolatcd strain i>t Ancylobactcr aquaticus. Appl. Environ. Microbiol. 60; 4199-4202.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Каковы преимущества биологических инсектицидов перед химическими?

2. Почему токсин Bacillus thuringiensis не токсичендля человека?

3. Какой подход вы использовали бы для идентификации гена протоксина Bacillus thuringiensis subsp. israilensis? Какое практическое применение может найти этот ген?

4. Как выяснить, где локализован ген определенного протоксина: в плазмиде или в хромосомной ДНК B. thuringiensis?

5. Как с помощью генной инженерии можно улучшить полезные свойства того или иного протоксина В. thuringiensis?

6. Как, используя методы генной инженерии, повысить эффективность бакуловирусов как инсектицидных агентов?

7. Каким образом можно расширить видоспецифичность токсинов?

348 ГЛАВА 15

8. Какую информацию вы можете получить, зная, к какому классу относится тот или иной белок Cry?

9. Как бы вы модифицировали белок Cry, чтобы уменьшить вероятность появления насекомых, утойчивых к токсину?

10. Почему бактерия Asticcacaulis excentricus является весьма привлекательным микроорганизмом для осуществления в ней экспрессии генов токсинов В. thuringiemis?

11. Как расширить круг насекомых, инфицируемых данным бакуловирусом?

ГЛАВА 16.
Промышленный синтез белков при участии рекомбинантных микроорганизмов

Для получения коммерческих продуктов с помощью рекомбинантных микроорганизмов необходимо сотрудничество специалистов в двух областях: молекулярных биологов и биотехнологов. Задача молекулярных биологов заключается в идентификации, изучении свойств, модификации нужных генов и создании эффективных систем их экспрессии в клетках микроорганизмов, которые можно будет использовать для промышленного синтеза соответствующего продукта, а задача биотехнологов — в обеспечении условий оптимального роста нужного рекомбинантного микроорганизма с целью получения продукта с наибольшим выходом. На заре развития молекулярной биотехнологии ученые наивно полагали, что переход от лабораторного синтеза к промышленному — это вопрос простого увеличения масштаба, т. е. условия, оптимальные для малых объемов, будут оптимальными и для больших, так что достаточно просто взять больший реактор и соответственно больший объем культуральной среды.

Такое упрощенное представление не соответствует действительности. Например, аэробные микроорганизмы хорошо растут в обычной колбе на 200 мл при аэрации ее содержимого с помощью мешалки мощностью 300 Вт. Если просто увеличить объем «колбы» до 10 000 литров, то потребуется мешалка мощностью 15 МВт. Ее мотор будет размером с дом, а при перемешивании выделится столько тепла, что микроорганизмы попросту сварятся. Этот простой пример может не во всем убедить биотехнологов, однако они точно знают, что проблема промышленного культивирования микроорганизмов не сводится к пропорциональному увеличению масштаба лабораторного эксперимента. Конечно, увеличить размер реактора (биореактора, ферментера) совершенно необходимо, поскольку для получения 10 000 л клеточной суспензии не имеет смысла использовать 50 000 отдельных колб на 200 мл. Однако помимо этого для получения максимального выхода как в малых (от 1 до 10 л), так и в больших (>1000 л) биореакторах необходимо оптимизировать множество параметров: температуру, pH, интенсивность и способ перемешивания культуры и — в случае аэробных организмов — концентрацию кислорода. При этом надо иметь в виду, что как правило оптимальные условия изменяются при каждом десятикратном увеличении объема биореактора.

Есть и другие очень важные соображения. В реакторе должен поддерживаться достаточный уровень стерильности и, кроме того, необходимо создать условия, предотвращающие утечку генетически измененных микроорганизмов. Чтобы иметь возможность быстро и легко изменять условия в ходе ферментации, реактор должен быть снабжен контрольно-измерительной аппаратурой, позволяющей непрерывно отслеживать значения как можно большего числа параметров. Поскольку при стерилизации может изменяться состав среды (например, могут разрушаться витамины), важно убедиться в том, что он остался оптимальным для роста нужных микроорганизмов.

Как правило, промышленная ферментация и очистка продукта — процессы многоступенчатые (рис, 16,1). Обычно процедура начинается с приготовления и стерилизации культуральной среды и оборудования. Сначала выращивают исходную культуру (5—10мл), затем инкубируют ее во встряхиваемой колбе (200—1000 мл), после