ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 4

Тема: Собирание в кучу органические остатки, солому и др., биодеградационная обработка и использование ее в производстве .

Цель: Изучить особенности роста микроорганизмов в условиях периодического культивирования.

Методическое обеспечение.Методические указания по выполнению практических работ.

Периодическое культивирование включает:

а) стерилизацию сред и всего оборудования;

б) загрузку биореактора питательной средой;

в) внесение посевного материала (клеток или спор);

г) выращивание культуры (это может совпадать во времени с последующим этапом или предшествовать ему);

д) синтез целевого продукта;

е) отделение и очистку готового продукта.

Все этапы представлены во временном аспекте; после окончания последнего этапа производится мойка биореактора и подготовка его к новому циклу. При этом типе культивирования рост клеточной популяции подразделяется на несколько фаз:

1) лаг-фаза, или фаза задержанного роста, при которой клетки растут медленно и адаптируются к новой среде обитания в объеме ферментора;

2) экспоненциальная фаза, характеризующаяся интенсивным делением клеток и сбалансированностью роста всей популяции;

3) фаза замедленного роста, связанная с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма;

4) стационарная фаза, при которой прирост новых клеток количественно равняется числу погибающих;

5) фаза отмирания, характеризующаяся прогрессирующей гибелью клеток.

Конструкция биореакторов

Все формы и виды ферментационных систем создаются, имея основной целью обеспечение одинаковых условий для всех компонентов содержимого реактора. В ферментерах биокатализаторы суспендированы в жидкой среде, содержащей необходимые субстраты для обеспечения роста организмов и образования нужного целевого продукта. Для создания оптимальной биореакторной системы необходимо точно придерживаться следующей генеральной линии:

• Биореактор должен быть сконструирован так, чтобы исключить попадание загрязняющих микроорганизмов, а также обеспечить сохранения требуемой микрофлоры.

• Объем культивирумой смеси должен оставаться постоянным, т. е. чтобы не было утечки или испарения содержимого.

• Уровень растворенного кислорода должен поддерживаться выше критических уровней аэрирования культуры аэробных организмов.

• Параметры внешней среды, такие, как температура, рН и т. п., должны постоянно контролироваться.

• Культура при выращивании должна быть хорошо перемешиваемая.

К материалам, используемым при конструировании сложных, прецизионно работающих ферменторов, предъявляются определенные требования (порой весьма строгие):

а) все материалы, вступающие в контакт с растворами, подающимися в биореактор, соприкасающиеся с культурой микроорганизма, должны быть устойчивыми к коррозии, чтобы предотвратить загрязнения металлами даже в следовых количествах;

б) материалы должны быть нетоксичным и, чтобы даже при самой малой растворимости они не могли бы ингибировать рост культуры;

в) компоненты и материалы биореактора должны выдерживать повторную стерилизацию паром под давлением;

г) перемешивающая система биореактора и места поступления и выхода материалов и продуктов должны быть легко доступными и достаточно прочными, чтобы не деформироваться или ломаться при механических воздействиях;

д) необходимо обеспечить визуальное наблюдение за средой и культурой, так что материалы, используемые в процессе, по возможности должны быть прозрачными.

Для оптимизации биотехнологических процессов требуется постоянный и тщательный контроль за изменяющейся картиной ферментации, что обеспечивается наличием в биореакторах соответствующих датчиков, позволяющих осуществлять избирательный анализ определенных параметров ферментационного процесса. Неотъемлемой частью большинства ферментаций является та или иная степень компьютеризации.

Самым главным направлением биотехнологии (основной задачей) является всемерная интенсификация производственных процессов, что достигается, с одной стороны, внедрением новых высокопродуктивных биологических объектов (продуцентов), а также широким применением эффективных технологических приемов (технологических режимов). Указанная цель достигается подбором подходящего сырья (субстрата для выращивания продуцента), разработкой наилучшей конструкции биореактора (ферментора), оптимизацией условий культивирования продуцента, обеспечением эффективного контроля за самим технологическим процессом, а также усовершенствованием способов выделения и очистки целевого продукта.

Питательная среда и посевной материал непрерывно поступают в аппарат, в котором нет обратного смещения. Аппарат выполнен в виде длинной трубы большого диаметра. Жидкость на входе в аппарат смешивается с посевным материалом. По мере их продвижения в аппарате одновременно осуществляются рост биомассы и процесс ферментации, движение не обязательно должно быть горизонтальным. В аппарате башенного типа жидкость движется снизу вверх. Такой способ часто выбираю для анаэробных процессов. Например, есть башенный способ производства пива.
Массовое культивирование организмов для биотехнологических целей достаточно хорошо разработано применительно к бактериям, дрожжам и мицелиальным грибам, и лишь сравнительно недавно начались интенсивные исследования в области выращивания культур клеток животных и растений. С помощью техники культивирования растительных клеток во многих странах с успехом готовится посевной материал для размножения определенных растений.

Для совершенствования методов культивирования растительных клеток явились работы по изучению органогенеза и амплификация проростков с последующим высевом их в грунт. Однако крупномасштабное выращивание суспендированных культур клеток многих видов растений уже разработано и используется для получения продуктов, типичных продуктам цельных растений: например, производство никотина, алкалоидов и женьшеня.

Получение конечного продукта метаболизма в производственном ферментаторе состоит основную и самую длительную стадию во всём технологическом цикле выращивания. Одно из основных требований, которые предъявляются к аппарату производственного культивирования сохранение стерильности при интенсивной аэрации питательной среды во время всего периода культивирования.

Стадия производственного культивирования для большинства микроорганизмов длится 48-72 часа (предельно от 24 часов до 12 суток).

Для успешного выращивания производственных культур большое значение имеет предотвращение пенообразования. Для этого используют химические (различные масла, силиконы) и механические средства пеногашения.

В процессе культивирования ведётся постоянный контроль за состоянием культуры и накоплением продуктов биосинтеза, фиксируется потребление основных компонентов среды, контролируется рН культуральной жидкости.

В микробиологической промышленности применяют поверхностный и глубинный методы выращивания микроорганизмов.

Поверхностный методприменим только для аэробных культур, причём их можно вырастить на твёрдой, сыпучей питательной среде или на поверхности тонкого слоя жидкой среды.

Глубинный методвыращивания может быть периодическим и непрерывным(проточным). При периодическом культивировании микробные клетки претерпевают значительные изменения в течение всего периода роста, обусловленные непрерывными изменениями окружающей среды и быстрой реакцией на них клеток.

Непрерывное культивированиеподразделяют на открытое и замкнутое. В открытых системах клетки постоянно вымываются вытекающей жидкостью со скоростью образования в системе новых клеток; в этих условиях легко достигается их устойчивая концентрация.

В замкнутыхсистемах клетки в какой-то мере задерживаются в системе и их количество постоянно возрастает.

Непрерывный процесс может быть гомогенно- и гетерогенно-непрерывным. При гомогенно-непрерывномпроцессе в ферментаторе все параметры (концентрация питательных веществ, скорость роста микроорганизмов) постоянны во времени. При гетерогенно-непрерывномпроцессе несколько ферментаторов объединяют в батарею. При этом в отдельных ферментаторах условия постоянные, но они могут быть отличными от условий в другом ферментаторе.

Известны методы культивирования, занимающие промежуточное положение между непрерывным и периодическим:

Объёмно-доливной – среда порциями подаётся в аппарат и также порциями отбирается из него;

Добавление питательной среды к культуре без её отбора. Этот метод удлиняет время культивирования, но приводит к более полному использованию всех имеющихся в среде элементов питания.

Контрольные вопросы

1. Что включает периодическое культивирование?

2. На какие фазы делится периодическое культивирование?

3. Основные требования к биореакторам.

4. Основные требования к материалам ферментеров.

Задание для СРСП:

1. Биотехнологическое получение ферментных препаратов.

2. Биотехнологическое получение органических кислот и аминокислот.

Задание для СРС: оформить результаты практической работы № 4. Ответить на вопросы для самопроверки. Подготовиться к опросу по темам лекции и СРСП.