Эндоспоры и другие покоящиеся стадии бактерий.

Эндоспоры – особый тип покоящихся клеток фирмакутных, т.е. бактерий с грамположительным типом оболочки, хотя некоторые образующие споры виды могут по методу Грама окрашиваться отрицательно.

К настоящему времени описано более 15 родов бактерий, образующих эндоспоры. Эти организмы различаются как морфологически, так и по физиологии и экологии. Образование спор является приспособлением, необходимым для существования соответствующих видов, так как позволяет переносить неблагоприятные условия среды.

Одна клетка образует одну спору, увеличения числа организмов при этом не происходит, поэтому эндоспорообразование не способ размножения бактерий. Эндоспоры представляют собою стадию покоя и приспособлены к перенесению неблагоприятных условий.

Способность к образованию спор определяется наличием специальных генов, комплекс которых иногда определяют как спорулон, хотя они не оформлены в виде какой-либо определенной структуры, но несколько их групп-оперонов расположены в различных участках хромосомы.

Для начала спорообразования необходимо завершение репликации хромосомы, причем сигнал к спорообразованию должен быть получен еще в период репликации. Если репликация заканчивается в богатой среде, наступает вегетативное деление. В процессе образования споры хромосома не реплицируется, таким образом, в спору попадает одна или несколько полностью реплицированных хромосом.

Процесс спорообразования принято подразделять на 6 последовательных стадий, смена которых определяется активированием соответствующих генов. При этом один из продуктов работающего по данной стадии оперона служит индуктором активности последующих генов, выключение любого этапа делает невозможными последующие. Депрессия споровых генов до 3-й стадии спорообразования (образование проспоры) обратима, и изменение среды может привести к их репрессии и переходу клетки к вегетативному росту.

Процесс образования споры довольно продолжителен, у аэробных мезофильных бацилл он занимает около 8 ч.

Стадия 1 характеризуется, прежде всего, необычным поведением ДНК, образующей осевой тяж вдоль клетки. У видов Bacillus осевой тяж проходит через всю клетку и включает в себя всю ДНК клетки, тогда как у некоторых видов Clostridium он образуется только частью содержащейся в клетке ДНК и располагается на одном из полюсов клетки, занимая лишь незначительную часть ее длины.

Конденсацию ДНК в относительно компактную структуру в процессе спорообразования связывают с изменением активности генома, с прекращением репликации хромосомы, транскрипции и трансляции вегетативных генов и потерей ДНК связи с рибосомами и мембраной. Показано, что на первых двух стадиях спорообразования активность генома низка.

Цитоплазма спорогенной зоны обычно не содержит включений запасных веществ.

Стадия 2 характеризуется отделением от осевого тяжа ДНК участка, соответствующего хромосоме, который движется к полюсу клетки. Затем часть цитоплазмы клетки с заключенной в нее хромосомой отделяется цитоплазматической мембраной, врастающей так же, как при клеточном делении, но здесь оболочка клетки участия в делении не принимает. В результате образуются две разделенные мембраной клетки, неравные по размерам. В это время процесс спорообразования еще обратим. Если бактерии перенести в условия, благоприятные для вегетативного роста, деление будет завершено слоями оболочки, и образуются две вегетативные клетки разной длины. Обе в дальнейшем могут делиться, хотя меньшая клетка медленнее.

События, происходящие на второй стадии спорообразования, определяются генами, по крайней мере 8 оперонов, расположенных в разных участках хромосомы.

Между 2-й и 3-й стадиями происходит врастание двойной мембраны или септы так, что в результате образуется округлая проспора, окруженная двумя мембранами. У некоторых видов в этом процессе принимает участие мезосома. Проспора в конце концов совершенно отделяется от мембраны материнской клетки и как бы свободно плавает внутри нее. На этом этапе происходит резкое изменение свойств мембран проспоры, на срезах они окрашиваются менее контрастно, чем цитоплазматическая. Считают, что в этот момент происходит изменение их транспортных свойств. Процесс спорообразования становится необратимым, причем не только для проспоры, но и для материнской клетки, которая уже не может вернуться к вегетативному росту.

Проспора остается у полюса клетки или, у некоторых видов, перемещается к ее центру. В процессе образования проспоры две окружающие ее мембраны оказываются расположенными зеркально, т.е. внешний, ранее обращенный к среде лепесток внутренней мембраны обращен наружу, а у внешней мембраны – внутрь. При этом, вероятно, эффективный транспорт веществ внутрь проспоры из цитоплазмы материнской клетки может обеспечиваться только за счет пассивной или облегченной диффузии.

После завершения образования проспоры бактерия начинает интенсивно потреблять из среды ионы Са²⁺, которые в конце концов могут составить до 2% от сухой массы споры и в молярном выражении превысить сумму всех других находящихся в споре катионов. Поступление Са²⁺ в спорангии, т.е. в спорулирующую клетку, происходит в результате энергозависимого активного транспорта, но из цитоплазмы спорангия в проспору он поступает за счет диффузии. Внутри проспоры образуется комплекс Са с дипиколиновой кислотой (ДПК), так что концентрация свободного Са²⁺ в проспоре оказывается низкой и не препятствует его диффузии из клетки.

На 4-й стадии между двумя мембранами проспоры начинается образование муреинового слоя. Процесс идет в 2 стадии. Сначала образуется примордиальный (зачаточный) слой, который после прорастания споры станет оболочкой проростка. Затем над ним откладывается несколько видоизмененный муреин, образующий толстый слой коры или кортекса. Синтез вещества кортекса является более кислым, чем муреин оболочки, за счет того, что многие остатки мурамовой кислоты не содержат пептидов или соединены лишь с 1–3 аминокислотами, которые не образуют сшивок и, следовательно, имеют свободные карбоксильные группы.

По мере развития проспоры происходит усиление ее способности к светопреломлению, вероятно, связанной с обогащением споры комплексом ДПК-Са. В фазово-контрастном микроскопе проспора выглядит серой. Способность к светопреломлению является характерной особенностью зрелой бактериальной споры.

На стадиях 3 и 4 проспора, выделенная из спорангия, осмотически нестабильна и нежизнеспособна.

На 5-й стадии спорообразования у бацилл начинают формироваться покровы споры. На срезах они сначала имеют вид отдельных коротких электронно-плотных линий или пластинок, расположенных в цитоплазме спорангия в 20–30 нм от наружной мембраны проспоры. Пластинки затем разрастаются и сливаются, образуя непрерывные слои вокруг споры. Внешняя мембрана проспоры становится плохо заметной на срезах, хотя, видимо, сохраняется в дальнейшем.

На 5-й стадии продолжается накопление спорой ДПК и Са, повышается устойчивость ее к органическим растворителям, например октанолу, хлороформу, спора становится светлой в фазовом контрасте. Она уже осмотически стабильна, но сохраняет термочувствительность. Выделенные из спорангия проспоры могут прорастать, при этом их прорастание индуцируется теми же индукторами, что и прорастание зрелых спор, но не наблюдается термоиндукции прорастания.

На 6-й стадии спорообразования заканчивается формирование всех характерных структур споры, она приобретает термоустойчивость. Иногда выделяют еще 7-ю стадию, на которой происходит лизис спорангия и выход споры в окружающую среду. При этом материнская клетка, или спорангий, до самого последнего момента сохраняет активность. Развитие споры определяется активностью двух геномов – материнской клетки и проспоры. Геном материнской клетки определяет синтез ДПК, белков, покровов споры, экзоспориума, выростов и газовых вакуолей у спор, содержащих эти структуры. От активности генома материнской клетки зависит образование ассоциированных со спорообразованием протеаз, антибиотиков и токсинов, а так же литических ферментов, образующихся на последнем этапе спорообразования. Определенная степень координации метаболизма материнской клетки сохраняется вплоть до ее лизиса.

Строение зрелой споры у разных видов соответствует одной и той же схеме. Сердцевина споры содержит белки и нуклеиновые кислоты, на их долю приходится не более 50–60% сухой массы споры, остальную ее часть составляют ДПК и другие низкомолекулярные вещества. Спора содержит так же рибосомы и различные ферменты, большинство из которых ничем не отличаются от соответствующих ферментов вегетативной клетки. Липиды вегетативной клетки и споры одинаковы, хотя количественное содержание определенных жирных кислот может быть различным.

Сердцевина споры окружена цитоплазматической мембраной, липиды которой находятся в упорядоченном кристаллическом состоянии геля. В их стабилизации, возможно, принимают участие ионы Са²+. Как уже говорилось, над мембраной находится примордиальный муреиновый слой, а затем толстый слой кортекса. Последний занимает 13–60% от объема споры, хотя образующий его муреин составляет всего 9–15% от массы споры. Это несоответствие объясняют высокой обводненностью кортекса. Даже довольно значительное его уменьшение может заметно не повлиять на свойства споры, но имеется определенный минимум массы кортекса, ниже которого спора теряет термоустойчивость

На срезах споры кортекс выглядит как массивный электронно-прозрачный слой, у покоящихся спор гомогенный, у прорастающих или разрушающихся – фибриллярный.

Как уже было отмечено, муреин кортекса является кислым за счет того, что только незначительная часть остатков мурамовой кислоты несет пептиды, часть занята только остатками L-аланина, а часть не соединена с аминокислотой и образует лактам.

Видимо, лактам, пептид и аланин чередуются в молекуле муреина. Состав пептидов кортекса может несколько отличаться от состава пептидов муреина оболочки. Длина нитей полисахаридной части муреина кортекса больше, чем у вегетативных клеток, и соответствует 80–100 дисахаридным остаткам. Синтез мурамового лактама начинается одновременно с синтезом ДПК.

Кортекс и зародышевая стенка кроме муреина содержат ряд литических ферментов, которые активируются при прорастании или при механическом нарушении целостности споры.

Снаружи кортекс ограничен внешней мембраной проспоры. Затем следуют покровы споры. Между мембраной и покровами находятся захваченные при спорообразовании участки цитоплазмы материнской клетки.

Над кортексом споры одеты слоистыми покровами, число и строение которых у разных видов бывают различны. У многих видов покровы дифференцированы на три слоя: внутренний, средний и внешний. Каждый из этих слоев в свою очередь может состоять из нескольких чередующихся электронно-плотных и электронно-прозрачных слоев. При этом внешний покров часто структурирован.

Покровы споры состоят из белка обычно с небольшой примесью углеводов и липидов, иногда содержат много фосфора.

У зрелой споры выявляются три основных слоя покровов, но они имеют комплексное строение. Внешний слой содержит белок, синтезированный одним из первых, и белок, синтезируемый на поздних стадиях спорообразования. Именно внешний покров обеспечивает устойчивость спор к лизоциму. Покровы споры обеспечивают ее устойчивость к лизоциму и другим ферментам, органическим растворителям, поверхностно активным соединениям, придают споре гидрофобность. Покровы чувствительны к щелочам, мочевине, сильным детергентам, например додецилсульфату. При нарушении целостности покровов сохраняется термоустойчивость и радиоустойчивость споры и ее способность к светопреломлению. При обработке крепкой кислотой спора разрывается и ее содержимое выходит. При этом, видимо, происходит освобождение Са²⁺ из его комплекса с ДПК, и спора разрывается за счет создавшегося высокого внутреннего осмотического давления.

Экзоспориум образует как бы свободный мешок, внутри которого лежит спора, контактируя с ним только в некоторых участках. Обычно в его состав входят белки, липиды, углеводы. Базальный слой экзоспориума образован белком и формируется в результате самосборки белковых молекул.

Экзоспориум, видимо, никогда не бывает полностью замкнутым, и ограниченная им цитоплазма сообщается с остальной частью цитоплазмы спорангия. Вместе с тем экзоспориум создает определенную компартментализацию цитоплазмы.

У многих видов рода Clostridium споры снабжены различными придатками и выростами. По классификации, предложенной В.И. Дудой, можно выделить 6 типов и 16 разновидностей выростов спор Clostridium. 1-й тип – трубчатые выросты, которые могут иметь капсулярный слой, латеральные разветвления или шляпки; 2-й тип – лентовидные выросты; 3-й тип – булавовидные выросты, располагающиеся на споре по одному или несколько перитрихиально; 4-й тип – фибриллярные тяжи; 5-й тип – волосовидные выросты, расположенные пучками на полюсе споры или по всей поверхности споры; 6-й тип – древовидные выросты. В составе выростов обнаружены белки, полисахариды, липиды. Предполагают, что выросты являются одним из средств пространственной организации (компартментализации) процессов в спорулирующих клетках.

Споры иногда окрашены и в массе выглядят желтыми или коричневыми. Споры не окрашиваются при использовании обычных методов, принятых в светооптической микроскопии, но без труда фиксируются методами, принятыми в электронно-микроскопических исследованиях. Характерной особенностью спор является способность к светоприломлению. Индекс светопреломления споры (около 1,55) близок к таковому сухого белка. Споры могут содержать до 79% воды, многократно высказывалось мнение, что эта вода сосредоточена только в районе кортекса, тогда как сердцевина обезвожена, имеются, однако, наблюдения, свидетельствующие о равномерном распределении воды в спорах.

Некоторые бактерии одновременно со спорами образуют параспоральные тела, которые не являются элементами спор или нормальными компонентами бактериальной клетки.

Бактериальные споры обладают уникальной устойчивостью к ряду неблагоприятных воздействий. Широко известная высокая устойчивость спор к температуре может быть различной и зависит от температуры, при которой происходит вегетативный рост соответствующего вида.

Повышенную устойчивость спор к ферментам, ядам, органическим растворителям можно в основном объяснить барьерной ролью белковых покровов споры.

Процесс прорастания споры принято подразделять на три стадии – активацию, инициацию и вырастание.

Активация означает готовность споры к прорастанию, при этом сохраняется ее устойчивость к температуре, способность к светопреломлению и др. Активация происходит в процессе старения спор, и тогда она необратима. Активация в сильной степени зависит от температуры. Активация может быть достигнута снижением величин рН, воздействиями редуцирующих агентов, в этих же случаях возможна деактивация.

Инициация прорастания необратима и длится в течение нескольких минут, при этом наблюдается определенная последовательность событий. Сначала снижается устойчивость споры к прогреванию, выход в среду ДПК-Са, спора становится темной в фазовом контрасте, хорошо окрашивается и, наконец, в среду начинает освобождаться глюкозамин и ДАП из растворяющегося кортекса. Происходит снижение светорассеяния суспензий спор. Процесс инициации зависит от температуры, влажности, величины рН раствора, но может происходить в условиях, исключающих вегетативный рост. Инициация нечувствительна к действию антиметаболитов, не зависит от присутствия источников азота, фосфора. Она может быть вызвана неспецифическими механическими воздействиями, обработкой спор ультразвуком, растиранием со стеклянными бусами, воздействием давлением несколько сот атмосфер. Подобная индукция инициации не является естественной и, вероятно, не имеет существенного биологического значения. Большой интерес представляет индукция инициации, вызываемая специфическими индукторами. Индукторами могут быть различные органические и неорганические вещества, очень часто некоторые аминокислоты.

Оказалось, что при спорообразовании в проспоре накапливается белок с молекулярной массой 46000, который в процессе созревания споры превращается в белок с молекулярной массой 4100, и, наконец, при прорастании споры в белок с молекулярной массой 40000, который и обнаруживает активность. Превращение белка с массой 41000 в белок с массой 40000 не требует затраты энергии, но дальнейшая деградация специфической протеазы – энергозависимый процесс.

Вырастание – это процесс активного роста, однако имеются некоторые отличия процессов, происходящих при вырастании и вегетативном росте. При вырастании идет активный синтез белка и РНК, но репликация ДНК начинается только через 1–2 ч после начала прорастания споры. Сначала происходят процессы репарации повреждений ДНК, произошедших в период покоя споры.

В процессе прорастания споры происходит лизис ее оболочек или их разрыв и выход проростка из оболочек. Тот или иной способ прорастания характерен для данного вида.

Образование эндоспор у некоторых видов может быть связано с прохождением бактерией специализированного жизненного цикла. Так, эндоспоры, одновременно являющиеся инфицирующей стадией организма, образуют бактериальный паразит нематод. Округлая спора находится внутри экзоспориума, имеющего чашевидную форму, и окружена кольцом фибриллярного материала. Плоская сторона этого комплекса прикрепляется к кутикуле нематоды, после чего спора прорастает в трубке, проходящей внутрь тела животного, где формируется примитивный мицелий. Отдельные клетки мицелия, сильно разрастаясь, превращаются в спорангии, в которых формируются споры. После лизиса зараженной нематоды споры оказываются в почве, где заражают новых животных. Из одной умершей нематоды может освободиться до 2 млн. спор.

По расположению в клетке выделяют типы спор. Бациллярный –спора располагается в центре клетки, клостридиальный – спора смещена от центра к одному из полюсов, плектридиальный – спора располагается полярно, приобретая вид барабанной палочки.

Кроме эндоспор у бактерий могут обнаруживаться также другие типы покоящихся стадий. Цианофиты, спирохеты, метилотрофные бактерии способны образовать цисты, содержащие вдвое больше липидов, чем вегетативные клетки. Некоторые фотосинтезирующие и метанолокисляющие бактерии образуют экзоспоры. Одна вегетативная клетка способна сформировать до 4 экзоспор.