Полуконсервативного способа репликации ДНК

До получения экспериментального подтверждения полуконсервативного способа репликации предлагались три варианта удвоения ДНК:

1. консервативный;

2. полуконсервативный;

3. мозаичный.

Н рисунке ниже изображены схемы консервативного и полуконсервативного способов репликации ДНК.

Мозаичный способ предполагает деградацию материнской ДНК до олигонуклеотидных фрагментов и дальнейшую сборку двух новых молекул ДНК как из этих фрагментов, так и с использованием новых нуклеотидов из цитоплазмы (кариоплазмы). Данная гипотеза сразу же вызвала большое количество нареканий, так как требует наличия аппарата запоминания информации, хранящейся в материнской ДНК, на время ее разрушения.

Таким образом, консервативный способ предполагает, что материнская ДНК полностью переходит к одной из дочерних клеток, полуконсервативный - каждой из дочерних клеток переходит по одной цепи от материнской ДНК, мозаичный - обе новые ДНК построены из смеси старых и новых олигонуклеотидных фрагментов.

В 1958 году Месельсон и Сталь с помощью только что разработанного метода центрифугирования в градиенте плотности доказали, что молекулы ДНК удваиваются полуконсервативным способом. Для этого E. coli выращивали в течение многих поколений в среде, содержащей в качестве единственного источника азота ¹⁵NH₄Cl. В результате такой процедуры весь азот ¹⁴N, содержащийся в исходной ДНК замещался на “тяжелый” ¹⁵N. Молекулы ¹⁴N-ДНК и ¹⁵N-ДНК различаются по массе всего на 1%. Однако этой разницы достаточно для разделения таких молекул ДНК в градиенте плотности хлористого цезия. Формирование линейного градиента плотности в центрифужной пробирке осуществляется при длительном центрифугировании пробирок, содержащих возрастающие сверху до низу концентрации хлористого цезия. В результате создается устойчивый градиент плотности от 1,66 до 1,76 г/см³. Под действием центробежной силы молекулы ДНК переходят в ту область градиента, в которой плотность раствора равна их собственной плавучей плотности. Высокополимерные молекулы ДНК образуют четко выраженную полосу, которую легко обнаружить по поглощению в ультрафиолете.

После полного замещения ¹⁴N в молекулах ДНК на “тяжелый” ¹⁵N, бактериальные клетки переносили в среду, содержащую ¹⁴NH₄Cl. При этом в результате последовательных клеточных циклов, каждый из которых включает репликацию ДНК, происходило постепенное обратное замещение "тяжелых" цепей ДНК на "легкие". Динамика изменения "тяжести" молекул ДНК при этом свидетельствовала о способе репликации. На рисунке показаны 3 возможных варианта размещения молекул ДНК в центрифужной пробирке в зависимости от их "тяжести".

При консервативной и полуконсервативном способах репликации должны были наблюдаться следующие изменения положения полос ДНК в центрифужной пробирке после каждого клеточного цикла.

Таким образом, полуконсервативный способ репликации ДНК, характеризуется исчезновением после первого же деления клеток "тяжелых" молекул ДНК, а также появлением гибридных молекул.

Мозаичный способ репликации характеризоваться появлением после первого деления расплывчатой полосы в районе гибридных ДНК с постепенным ее сдвигом вверх при последующих делениях.

Результаты, полученные Месельсоном и Сталем, свидетельствовали именно о полуконсерватив-ном способе репликации ДНК.