Способи культивування протопластів

Існують два способи культивування протопластів: метод рідких крапель і метод платування.

У першому випадку суспензію протопластів у вигляді крапель поміщають на пластикові чашки Петрі. Варіацією цього способу є культивування одиничних ізольованих протопластів у мікрокраплях об'ємом 1 мкл, запропоноване Ю. Глєбом в 1978 р.

У другому – суспензію протопластів наливають у пластикові чашки Петрі, додають рівний об'єм того ж середовища з 1% агаром при температурі не вище 45ºС. Після охолодження чашки Петрі перевертають і культивують при 28ºС. У даному випадку протопласти фіксовані в одному положенні і фізично відокремлені один від одного. Це дає можливість спостерігати за розвитком інтактного протопласта: формуванням клітинної стінки, розподілом, ростом і розвитком рослини. Варіантом цієї техніки є використання годуючих протопластів або клітин, підданих дії рентгенівського або γ-випромінювання, що блокує їх здатність до поділу. Такі протопласти або клітини змішують з життєздатними протопластами і вони підтримують і стимулюють їх ріст.

Відразу після видалення розчину ферменту починається утворення клітинної стінки. Важче домогтися поділу клітин і регенерації рослин. Регенерація рослин здійснюється або через ембріогенез, або через розвиток каллусу з подальшою індукцією морфогенезу. Домагаються цього додаванням в середу ауксинів або поєднання ауксинів з цитокінінами.

На проліферацію клітин, що виникли з протопластів, впливає 4 фактори:

– видова специфічність і фізіологічний стан вихідної тканини рослини,

– спосіб і умови виділення протопластів,

– густина висіву протопластів,

– склад поживного середовища.

Злиття протопластів (парасексуальная гібридизація)

Ізольовані протопласти, які ще не утворили клітинної стінки, можуть зливатися між собою. Злиття протопластів – своєрідний метод гібридизації, так звана парасексуальная, або соматична гібридизація. На відміну від звичайної, де зливаються статеві клітини (гамети), в якості батьківських при парасексуальной гібридизації використовуються диплоїдні клітини рослин. Позаядерні генетичні детермінанти у більшості вищих рослин успадковуються в статевому процесі суворо одноядерними і материнськи. Техніка парасексуальной гібридизації може дозволити:

– схрещування філогенетично віддалених видів рослин (організмів),

– отримання асиметричних гібридів, що несуть генний набір одного з батьків разом з кількома хромосомами, органелами або цитоплазмою іншого,

– злиття трьох і більше клітин,

– отримання гібридів, що представляють суму генотипів батьків,

– перехід мутацій в гетерозиготний стан, що дозволяє отримувати життєздатні форми при злитті протопластів, оскільки мутагенез досить часто дає дефектну по морфогенезу рослину,

– отримання рослин, гетерозиготних за позаядерними генами та ін.

Парасексуальная гібридизація важлива для аналізу як ядерних генів, так і позаядерних геномів. Цитоплазматичний геном кодує ряд ознак – швидкість фотосинтезу, стійкість до патогенів, абіотичних факторів і т. д. Наявність косегрегація генів (ознаки, контролюючі позаядерний геном, сегрегуються спільно) свідчить про фізичне зчеплення генів.

Злиття буває спонтанним (частіше у протопластів з молодих тканин або суспензійних культур) і індукованим. Для стимуляції злиття протопластів запропоновано ряд методів, як фізичних, так і хімічних.

При фізичному способі злиття протопластів, розробленому Г. Циммерманом з співробітниками в 1981 році, протопласти поміщають у камеру з неоднорідним електрополем. На електродах утворюються агрегати з 2 – 3 протопластів, або ланцюжка з 5 – 6 протопластів між електродами. Додатковий одиничний імпульс постійного струму призводить до утворення пор в сильно стиснених мембранах, відбувається перетікання цитоплазми, так як змінний струм утримує протопласти разом деякий час, і протопласти в таких агрегатах зливаються. Згасаючий струм приводить до повернення сферичної форми протопластів, що злилися.

В основі злиття лежить різна дія постійного і змінного електричного струму на плазмалему. Постійне еклектичне поле стискає мембрани, ведучи до їх локального руйнування, а змінне електрополе викликає латеральну дифузію білків мембрани, утворюючи вільні від глікопротеїдів ліпідні області, де протилежні мембрани можуть встановити контакт.

Частіше для індукції злиття протопластів використовують методику "ПЕГ – високі значення рН – висока концентрація Са²⁺", яка дає до 50% злитих протопластів (рН 9 – 11, концентрація Са²⁺ 100 – 300 ммоль/л). У присутності поліетиленгліколю спостерігається сильна адгезія протопластів, після видалення поліетиленгліколю і додавання кальцію – їх злиття. Припускають, що рН та іони кальцію збільшують текучість мембран, що пов'язане з їх рідинно-мозаїчною структурою.

При злитті протопластів різних рослин, наприклад, А і В, можуть з однаковою ймовірністю утворюватися комбінації АА, ВВ і АВ. Бажаний продукт злиття – АВ, тому розробляються способи збільшення частоти злиття саме такого типу і виборчого виділення лише продукту злиття АВ. Один з таких методів полягає в наступному. Поверхня протопласта зазвичай несе негативний заряд. Шляхом обробки її фосфоліпідів, що несе позитивний заряд, можна тимчасово надати поверхні протопласта позитивний заряд. Якщо тепер протопласти А, що мають позитивний заряд, змішати з необробленими протопластами В, що несуть негативний заряд, то будуть в основному утворюватися комбінації АВ в результаті притягання різнойменних зарядів.

Розроблено також методи маркування протопластів тієї чи іншої рослини за допомогою різних флуоресцентних барвників. Якщо обробити протопласти однієї рослини флуоресцеїнізотіоціанатом (FITC), а протопласти іншої рослини родамінізотіоціанатом (RITC), то можна, не змінюючи активності клітин, позначити їх жовто-зеленою (FITC) або червоною (RITC) флуоресценцією. Гібриди, що утворилися шляхом злиття різних типів клітин, будуть мати обидва кольори флюоресценції – жовто-зелений і червоний.

Протопласти можуть зливатися як попарно, так і в більшій кількості. Багатоядерні продукти злиття, як правило, руйнуються. Перше повідомлення про отримання соматичних гібридів на рівні рослин з'явилося в 1972 році (Карлсон і колеги), в нашій країні таке здійснили в лабораторії Бутенко Р.Г. в 1975 році.

Доля геномів (ядерного та цитоплазматичного), після злиття протопластів може бути різною:

1. Ядерні генетичні детермінанти успадковуються як дво-, так і однобатьківські. В останньому випадку ядра не зливаються і згодом сегрегуються в процесі клітинних поділів.

2. Позаядерні генетичні детермінанти успадковуються двобатьківсько. При цьому у міжвидових комбінаціях простежується тенденція до соматичного відщеплення та елімінації одного з батьківських цитоплазматичних геномів.

3. Виникнення гібридних клітин і рослин у результаті злиття більш ніж двох батьківських клітин.

Таким чином, злиття протопластів призводить або до утворення гібрида, або до утворення цибридів. Соматичний гібрид – продукт злиття і цитоплазми, і ядра обох протопластів. Цибрид (цитоплазматичний гібрид) – рослина-регенерант, що містить цитоплазму обох батьків і ядро одного з них. Цибриди отримують, опромінюючи перед злиттям один з протопластів γ-променями для руйнування ядра. Скринінг таких клітин проводиться за генами – маркерами ядерного і цитоплазматичного (мітохондріального та хлоропластного) геномів. Є вказівки на рекомбінацію ДНК мітохондрій і хлоропластів в гібридних клітинах (Ю.Ю. Глеба, К.М. Ситник, 1984).

При злитті можуть утворюватися і так звані асиметричні гібриди – продукти злиття, що мають повний хромосомний набір одного з партнерів і частину хромосом іншого партнера. Такі гібриди часто виникають при злитті клітин, філогенетично віддалених один від одного. У цьому випадку внаслідок неправильних поділів клітини, обумовлених некоординованою поведінкою двох різнорідних наборів хромосом, в ряді поколінь втрачаються частково або повністю хромосоми одного з батьків. Асиметричні гібриди бувають стійкіші, плодовитіші і життєздатніші, ніж симетричні, що несуть повні набори генів батьківських клітин. З метою асиметричної гібридизації можлива вибіркова обробка клітин одного з батьків для руйнування частини його хромосом. Можливе прицільне перенесення в клітину потрібної хромосоми.

Гібриди можуть бути отримані шляхом злиття трьох і більше батьківських клітин. З таких гібридних клітин можуть бути вирощені рослини – регенеранти.