Антибиотиктердің микробиологиялық синтезі

Микробиологиялық синтез дақылдандыру ортасын дайындаумен басталады. Субстрат микроорганизмдердің жақсы өсіп көбейюіне керек, арзаң және жеткілікті табу алатындай болуға тиісті. Қоректік ортаны дайындау цехында немесе бірден биореакторда ылғал бумен және қысыммен стерилизациясы жүреді. Бір мезгілде егу материалы дайындалынады, өндіруші штамның таза дақылының көлемі бір ізділікпен өсіріледі (1-10-100 және одан да көп литрлер). Келесі этапы – бірнеше тәулік бойы аэробты, тереңді, кезеңдік ферментация; бұл өндіруші микроорганизм түріне, биореактор көлеміне және т.б. байланысты. Ферментация процесінде оптимальды температура, рН, рО2, тұрақты араластыруы және аэрация (егер өндіруші микроорганизм аэробты дақыл болса қолданылады) және химиялық пен физикалық тәсілдер қолданып көпіршіктерді алып тасталынуы ұстанылады.

Антибиотикалық заттар екіншілік метаболиттер болғандықтан, олардың биосинтезі өндіруші дақылдары идиофазаға ауысуымен байланысты. Сондықтан, осы фазада өндірушінің өсуін лимиттеу қажет. Пенициллин биосинтезінде лимиттеуші фактор ретінде глюкоза болады, ал стрептомицеттердің антибиотиктер биосинтезіне фосфаттарды қатыстырады. Осылардың барлығы антибиотиктер биосинтезі процесінде өндіруші штамға арналған қоректік орталар рецептурасын құрастыруға аса маңызды. Мысалы, пенициллин өндіруіне арналған қоректік орта құрамына глюкоза - 1,5%, лактоза - 5% (лактоза глюкозаның катаболизмдік репрессиясын жойып отырады), аммоний сульфаты және фосфаттар - 0,5-1%, жүгері экстракті - 2-3%, антибиотиктердің бастауыштары - фенокси- немесе фенилсірке қышқылы - 0,3-0,6%, бор - 0,5-1%, көпіршікті басатындар - 0,5-1%; ферментация температурасы 22-26⁰ С деңгейде болуға тиісті, орта рН 5,0-7,5 және аэрациясы – 1 минутта 1 м³ ортада – 1 м³ ауа болу; ферментация ұзақтығы - 4 тәулікке созылады.

"Талғамсыз қоректенетін" актиномицеттер қоректік ортада ақуыздар (соя ұны, балық ұны, бидайдың кілегейлі ақуыздары және т.б.), крахмалы бар қоректік ортада өсуге және антибиотиктер өндіруге қабілеттілік береді. Дегенмен, регламентті құжатта берілген әр өндірушінің өзгеше ерекшеліктері болады. Мысалы, Streptomyces kanamyceticus егу материалын соялы-крахмальды ортада өсіреді және онда негізгі ферментацияны 27-28⁰ С температурада, орта рН 7,1-7,6 сақтауда 4-5 тәулік бойы жүргізеді. Str. floridae (виомицин немесе флоримицин өндірушісі) ферментациясына глюкоза немесе гидрол, соя ұны, жүгері экстракті, нитраттар, боры бар қоректік ортаны ұсынылған; температураны 27-29⁰ С, орта рН 7,0-7,3 деңгейде ұстанады. Str. erythreus ферментациясына қоректік орта құрамына эритромицин бастауышы ретіндегі пропил спиртін қосады. Нистатинді өндіретін Str. nеurаsei аммоний азотын (нитратты емес) қарқынды қабылдайды және т.б.

Мысалы, Penicillium chrysogenum дақылдандыруында микроорганизм глюкоза қарағанда лактозаны әлсіз қабылдайды, ал бұл антибиотик шығысына әсерін тигізеді. Егер ортада көміртегі көзі ретінде тек глюкоза болса, саңырауқұлақтың барлық алмасу процестері қарқынды түрде өтеді. Осындай жағдайда пенициллиннің пайда болу максимумы дақылдың 50 сағат дамуында байқалады, сондықтан антибиотик биосинтезі деңгейі төмен болады. Лактоза қатысуында антибиотик түзілу максимумы 150-160 сағатта өткенімен пенициллин шығысы жоғарлайды. Сондықтан, пенициллинді алу практикасында глюкоза және лактозаны бірге қолдануы ықтимал, саңырауқұлақтың жақсы дамуына және пенициллиннің биосинтез деңгейі жоғарлайды, антибиотик өндірісі рентабелділігі артады.

Str. aureofaciens дақылында хлортетрациклин биосинтезі үшін көміртегі көзі ретінде ортаға глюзаны қосады. Айта кету керек, ортада глюкозаның деңгейі 3% жоғарлаған болса, ал басқа компоненттер өзгермеген қалыпта қалса, антибиотик шығысы төмендеуін ескеру қажет.

Макро- және микроэлементтерде микроорганизмнің биоөндіруші активтілігіне өз үлестерін қосады. Олардың көпшілігі кейбір ферменттердің құрылымды бөлігі ретінде микробтық клетканың протоплазма құрамына кіреді, осмостық қысымды реттейтін немесе клеткалар протоплазмасының гидрофильділігін өзгертетін компоненттер ретінде жұмыс атқарады. Ортада фосфордың жетіспеушілігі актиномицеттердің зат алмасуы кұрт өзгертеді, себебі азот пен көмірсуларды қабылдау және сіңірілу бұзылыстары байқалады. Сонымен қатар, ортада фосфордың шектен тыс көп болуы организмнің метаболизміне кұрт әсер етеді. Мысалы, стрептомицинді өндіретін Streptomyces griseus ортада фосфор концентрациясы өзгерісіне сергек сезінеді; жоғарлағанда антибиотик шығысы кұрт төмендейді. Аналогиялық өзгерістер тетрациклин текті антибиотиктер өндірушілеріне тән (Streptomyces aureofaciens, Str. rimosus), аурантин өндірушісіне (Str. auranticus) және басқа микроорганизмдерге де. Ортада күкірт концентрациясы өзгеруі P.chrysogenum мицелласының физиологиялық жағдайын өзгертеді және пенициллиннің биосинтез деңгейіне әсер етеді. Бұл жерде күкірт саңырауқұлақ мицелийіне фосфорға ерекше бәсекеші ретінде әсер етеді. Фосфордың концентрация деңгейі жоғарлауы антибиотик өндірмейтін I-III ересек фазадағы саңырауқұлақ мицелийі дамуы байқалады. Ал күкірттің концентрациясы жоғарлауы, керісінше, саңырауқұлақтың ең көп салмақты биомассасы өндіруші мицелийдің IV-VI ересек фазаларда даму қабілетін күшейтеді.

Антибиотиктерді өндіретін көптеген бактериялар нейтралды ортада көбейеді (рН 7,0). Дегенмен, низин синтездейтін сүтқышқылды стрептококктар орта рН 5,5-6,0 жақсы көбейеді. Көптеген антагонистті актиномицеттер алғашында орта рН 6,7-7,8 аралықта ұстанғанда жақсы дамиды. Көптеген жағдайда актиномицеттер орта рН 4,5-4,0 төмендегенде көбейе алмайды.

Көптеген бактерияларға тиімді температурасы 30-37⁰ С құрайды. Грамицидин С өндіруші Bacillus subtilis-ке тиімді өсу температурасы – 40⁰С. Дегенмен, бұл микроорганизм 28⁰ С жақсы көбейіп антибиотикті қалыпты синтездей алады, бірақ дақылдық ортада грамицидиннің жиналу максимумы 24 сағатқа кешігеді. Актиномицеттер – антибиотиктердің өндірушілері, 26-30⁰ С температурада дақылданады, стрептомицеттердің кейбір түрлері төменгі (0⁰-тан 180⁰ С) және жоғарғы температурада (55-60⁰ С) өседі. Көптеген мицеллалы саңырауқұлақтарға тиімді өсу температурасы - 25-28⁰ С.

Антибиотиктер синтезін күшейту үшін қоректік ортаға бастауыш метаболитті енгізу керек. Бензилпенициллин үшін – бұл фенилсіркесу қышқылы, макролидті антибиотиктер үшін – пропион қышқылы және пропил спирті, пептидті антибиотик грамицидин S үшін – L-фенилаланин және т.б.

Кей жағдайда екі фазалы ферментация қолданылады: алдымен арзаң және қол жеткізетін субстратта жылдам дақылдың биомассасы жинақталынады, кейін орта дақылына қажетті антибиотиктің өнімін жоғарлату үшін бастауыш метаболиттер қосады. Бастауыштарды ферментациялық ортаға микроорганизм дақылының экспоненциалды даму фазаның аяғында енгізеді (кезеңдік ферментацияда), себебі антибиотиктің биосинтезі жоғарлауы бәсендеп дамитын өсу фазасында (трофофаза соңы) басталып, стационарлық фазада, идиофазада максимумға жетеді.

Кейін ферментациялық биомассаны өндеу жүргізіледі: фильтрация, егер дақылдық сұйықтықта антибиотик жинақталынса; егер антибиотик клетка ішінде жиналатын болса, клеткаларды тұнбалайды, антибиотикті алу мақсатында клетканы ыдыратады. Дақылдық ортадан антибиотикті бөліп алу алдында қатты немесе тығыз фазаны сұйықтыдан ажырату қажет. Осындай жағдайда фильтрация қолданылады. Тығыз фазаның сапасы фильтрация нәтижесіне әсер көрсетеді. Келесі заңдылық байқалады – нативті бактериялық массаның сүзгіден өтуі әлсіз жүреді, мицеллалы микроорганизмдерге қарағанда. Жоғарғы актиномицеттер жіпшелі құрылымды болғандықтан сүзгіден өтуінде жеңіл ажыратылады, бактериялармен салыстырғанда.

Дақылдық ортадан антибиотиктерді бөліп алу айтарлықтай қиындықтар тудырады, себебі дақыл ортасы көп компонентті және мақсатты өнімнің шығысы аздаған концентрацияда болады. Мысалы, субстраттың шығысы 8% болғанда пенициллин шамамен 30 г/л тен жинақталынады. Дегенмен мицеллалардан құрғақ заттар салмағы 3-6%, ал олардың ішінде 15-30% ғана антибиотикалық қосылыстарды құрайды. Сондықтан, барлық дақылдық ортаны өндегенде антибиотикалық заттар көп бөлінетін сатыға ауыстырылуы қажет. Кей жағдайларда дақылдық ортаны қышқылдау (тетрациклин) немесе керісінше сілтілеу (новобиоцин) мақсатта тұздар, щавель қышқылы (эритромицин) және т.б. қосумен іске асады.

Антибиотиктерді бөліп алу, технологиялық процесінің түрлі сатысында оларды концентрациялау мақсатында экстракция, ионды алмастыратын сорбция, хроматографиялық әдістер (нәзік қабатты хроматография), шөгу және т.б. әдістер жүргізіледі. Өндірістік штамдардың ферментация процесінде клеткалық биомассада жинақталған антибиотикалық заттарды басқа әдістермен бөліп алады, дақылдық ортадан микроорганизмдер бөлетін антибиотиктерді алуынан ерекшелігі. Бірінші жағдайда, нативті немесе дезинтегрирленген микробтық клеткалардан алынған ерітінділерімен экстракция жүргізу қажет.

Эстракция дегеніміз антибиотикті алдымен тұнбалап кристаллизациясын жасай отырып антибиотикті бір ерітіндіден келесіге ауыстыруы, қажетті тазалыққа ие субстанцияны алу үшін көп рет кристаллизация жасау керек.

Ионды алмастыру арқылы сорбция теріс зарядты антибиотиктердің катионды смолаға шоғырлануына негізделген, әрі қарай шайырға адсорбцияланған антибиотик ерітінділермен араласады. (элюиция). Тұнбалау барысында антибиотик тұңбаға түсетін органикалық немесе бейорганикалық заттармен қосылады. Кейін экстракция үрдісі басталады.

Гомогенді күйде бөлінген антибиотикті желдеткішпен немесе лиофильді кептіргішпен кептіреді, биологиялық активтілігін сақтау мақсатта тұрақтандырады, дәрілік формаға келтіреді.

Аяқталу кезеңінде дайын препарат биологиялық (стерильдігі) және фармакологиялық (улылығы, пирогенділігі және т.б.) бақылаудан өтеді.

Сонымен өндірістік микроорганизмдер штамдарының антибиотик өндіруші активтілігі көптеген факторлар жиынтығына байланысты. Өндірушінің сапалық сипаттамасымен қоса олардың қатарына қоректік орта құрамы, оның қышқылдылығы, тотығу-тотықсыздану потенциалы, дақылдандыру температурасы және басқа да параметрлер жатады. «Дақылдандыру ортасы» түсініктемесіне микробтық клетканың конструктивті және энергиялық алмасуына міндетті түрде қажет ететін (азот, көміртегі, фосфор, бір қатар микроэлементтер, витаминдер және өсіретін заттар көздері) компоненттерінің сапалық және сандық құрамы ғана емес, тағы физикалық-химиялық факторларды қажет етеді (қоректік ортаның қышқылдылығы, тотығу-тотықсыздану потенциалы, температура, аэрация, гомогенділігі және т.б.).

Антибиотиктер өнімінің реттелуі кері байланыс механизмі бойынша атқарылады (ретроингибирлеу), антибиотиктердің шектес тыс көп шығысы бастапқы фермент биосинтезі активтілігін тежейді немесе осы метаболизм жолдарындағы барлық ферменттерді тежейді. Өндірістік өндіруші ретінде ауксотрофты штамдар алынған жағдайда ретроингибирлеу механизмі әлсіз, ал ақырғы өнімнің – антибиотиктің синтезі жоғарлауы орын алады.