ВИТАМИНЫ. Низкомолекулярные органические соединения, присутствующие в живых клетках в очень низких концентрациях

Низкомолекулярные органические соединения, присутствующие в живых клетках в очень низких концентрациях, участвующие во всех биохимических и физиологических процессах как важнейшие регуляторы жизнедеятельности. Оказывают сильное и специфическое влияние на рост, развитие и обмен веществ. В отличие от белков, жиров и углеводов количественные потребности организма в витаминах ничтожны. Они играют роль биокатализаторов. Витамины группы В входят в состав ноферментов ряда ферментов, участвующих в углеводном, белковом и жировом обмене. Витамины группы В (тиамин, никотиновая кислота, рибофлавин), а также ретинол, кальциферолы, токоферолы могут участвовать в процессах и реакциях не только в роли коферментов. Например, тиамин и его коферментные формы участвуют в регуляции синтеза макромолекул, рибофлавин - в образовании митохондриальных мембран. Витамин С, a-токоферол, b-каротин обладают антимутагенным действием. Отсутствие или недостаток витаминов в организме приводит к нарушению обмена веществ, возникновению заболеваний. Человек и высшие животные нуждаются в поступлении витаминов извне.

Первичная цель применения витаминов лечебная, в последнее время основное их количество используется для обогащения кормовых и пищевых рационов.

При обогащении кормовых рационов витаминами резко снижается гибель молодняка сельскохозяйственных животных и птицы, возрастает усвояемость кормов, ускоряется рост, повышается резистентность организмов к заболеваниям, снижаются затраты на единицу продукции или прироста, появляется возможность заменить дорогостоящие и дефицитные корма животного происхождения более дешевыми растительными. Эффект от применения витаминов в животноводчестве связан с недостаточным содержанием некоторых из них в кормах, а также при их заготовке и хранении содержание витаминов снижается.

Витамины используются для интенсификации биотехнологических производств. Например, добавление каротиноидов увеличивает синтез антибиотиков, ферментов, белка, глюкозы, органических кислот, спиртов и т.д. Имеются сведения о применении витаминов в растениеводстве. В Литовской сельхозакадемии в 1982 г. показано, что опрыскивание посевов моркови раствором пиридоксина позволило увеличить урожай на 45,6%, в таких же пропорциях получен эффект и при опрыскивании моркови этим витамином перед хранением.

Экспериментально обоснована связь витаминов с белками. Установлено, что усвоение белка организмом зависит от витаминного комплекса. В середине ХХ в. возросла потребность в сбалансированных кормах. Оказалось, что именно микробиологический синтез наиболее рентабелен при производстве витаминов для животноводства и растениеводства. Поэтому он стал основой промышленного производства для этой цели. В настоящее время изучен механизм биологического синтеза тиамина, рибофлавина, биотина, эргостерина, кобаламинов, коротиноидов и убихинонов, получены представления о путях регуляции этих процессов.

Биосинтетические способы более перспективно применять при синтезе особо сложных по строению витаминов порфириновой и стероидной природы, коэнзимных форм витаминов. Сейчас этим способом производят рибофлавин и витамин В₁₂. Микроорганизмы используются также, как селективные окислители сорбита в сорбозу при получении аскорбиновой кислоты (вит. С), частично - для производства витаминных концентратов b-каротина (провитамина А), эргостерина и коэнзимных форм ряда витаминов (кофермента В₁₂, ФАД, коэнзима А). Изучены культуры - продуценты тиамина, пиридоксина, биотина. Теоретически с помощью микроорганизмов можно получить все известные в настоящее время витамины и в этом направлении ведутся изыскания. Необходимо отметить, что наряду с раздельно получаемыми витаминами, специально выпускаемыми для сбалансирования кормовых рационов, в качестве источника некоторых витаминов группы В используется белково-витаминный концентрат, содержащий витамины этой группы. Например, при культивировании дрожжей на углеводородах они могут содержать витамины в количестве, мкг/г сухой биомассы: рибофлавин - 45-220; тиамин - 5-50; биотин - 0,3-3,0; инозит - 400-5700; фолиевая кислота - 3,4-34; парааминобензойная кислота - 3-62; пантотеновая кислота - 30-160; пиридоксин - 9-30; никотиновая кислота - 100-170 (Т.Е.Попова, 1968). Количество витаминов, синтезированных клеткой зависит от штамма и условий культивирования: аэрации, содержания микроэлементов, азота, рН и др. Источниками витаминов группы В могут быть бактерии, водоросли, грибы. Наиболее крупные страны - производители витаминов: США, Япония, Франция, Германия. Ведущую роль в производстве витаминов играет швейцарский концерн Hoffman La Roche, который выпускает от 50 до 70 процентов всех витаминов.

Витамин В₁₂ (цианокобаламин)

Неполимерное соединение с очень сложным строением - a(5,6 диметилбензимидазол)-кобамидцианид. Группа витаминов В₁₂ называется корриноиды. В 1972 г. через 25 лет после открытия витамина В₁₂ был осуществлен химический синтез корриноида. Весь процесс состоял из тридцати семи последовательных ступеней. В силу сложности такого синтеза микробиологический метод остается единственным промышленным способом получения витамина. В настоящее время сложилось мнение, что цианокобаламин (В₁₂) не индивидуальное вещество, а группа корриноидных соединений с вариациями в a- и b-лигандах. В качестве b-лиганда он несет группу циана, но может быть замещен группой ОН (оксикобаламин) или группой СН₃ (метилкобаламин), 5'-дезоксиаденозильным остатком (5'-дезоксиаденозилкобаламин).

Витамин В₁₂ участвует в обменных реакциях организма: регулировании жирового и углеводного обмена, в превращении и катаболизме незаменимых аминокислот - метионина, треонина, валина, лейцина, изолейцина и т.д. Он участвует и в модификации нуклеиновых кислот, обеспечивает организм позвоночных предшественником гемоглобина крови. В медицине его применяют для лечения злокачественной (пернициозной) анемии, для срастания костных тканей после перелома, при лучевой болезни, заболеваниях печени, полиневритах. Витамин В₁₂ имеет большее значение для животноводства, при его использовании растительные корма полноценнее усваиваются без включения в рацион дефицитных белков животного происхождения, повышается прирост массы на 10-15% и продуктивность. Необходимость промышленного получения витамина В₁₂ для животноводства заключена в том, что применяемый кормовой белково-витаминный комплекс, состоящий из дрожжевой биомассы, не имеет витамина В₁₂.

Продуцентами при промышленном синтезе витамина В₁₂ могут быть актиномицеты и родственные им организмы, пропионовокислые, метанообразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли и т.д.

Представители рода Рropionibacterium способны активно синтезировать витамин В₁₂. Природные штаммы образуют 1,0-8,5 мг/л корриноидов, однако мутант Р.shermanii М-82 выделяет до 58 мг/л витамина. Среди представителей семейства Propionibacterium имеются другие виды также способные вырабатывать подобный продукт, прежде всего это Eubacterium limosum (Butyribacterium rettgerii). Истинный витамин В₁₂ в значительных количествах синтезируют представители актиномицетов, в частности Nocardia rugosa - до 18 мг/л. Активные продуценты обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M.purpureae, M.echinospora, M.halophitica, M.fusca, M.chalceae. Среди метаногенов можно отметить Methanosarcina barkeri, M.vacuolata, отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus (до 16 мг/л). Корриноиды синтезируют и облигатные анаэробы Clostridium tetanomorphum и Cl.sticklandii, у которых аденозилкобаламин входит в состав ферментных систем, катализирующих специфические реакции изомеризации аминокислот: глутаминовой, лизина, орнитина. Витамин В₁₂ образуют ацетогенные клостридии Cl.thermoaceticum, Cl.formicoaceticum, а также Аcetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО₂. Pseudomonas denitrificons, штамм МВ-2436 синтезирует до 59 мг/л корриноидов. На фирме Мерк в США этот штамм используют в качестве основного продуцента витамина В₁₂. Интерес представляют термофильные бациллы: Bacillus circulans, растущая при температуре 60⁰С и Bac.stearothermophilus - при температуре 75⁰С, которые за 18 часов культивирования дают 2,0-6,0 мг/л витамина. Корриноиды выделяют Rhodopseudomonas palustris, фототрофные пурпурные бактерии Rhodobacter sphericus, Rh. capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Chromatium vinosum, синезеленая водоросль Anabaena cylindrica, одноклеточная зеленая водоросль Chlorella pyrenoidosae и красная водоросль Rhodosorus marinus. Продуценты витамина В₁₂ культивируют на средах, как на основе пищевого, так и непищевого сырья: соевой и рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта, изопропилового спирта, метанола и пропандиола, выделяя при этом от 1,1 до 160 мкг/л.

В качестве примера рассмотрим получение витамина с использованием пропионовокислых бактерий, в частности Рropionibacterium freudenreichii var. shermanii.

Бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта, сульфат аммония. Кислоты, образующиеся при брожении, нейтрализуют раствором щелочи, непрерывно поступающей в ферментер. Через 72 ч в культуру вводят предшественник - 5,6-диметилбензимидазол (5,6-ДМБ), это необходимо, так как в отсутствие 5,6 ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В₁₂ не имеющий клинического значения. Ферментацию заканчивают через 72 часа. Биомассу сепарируют, водой из нее экстрагируют витамин, который накапливается в клетках. Экстракция происходит при рН 4,5-5,0 ед и 85-90⁰С в течение 60 мин с внесением стабилизатора 0,25% р-ра NaNO₂.

Водный раствор витамина В₁₂ охлаждают, доводят рН до 6,8-7,0 ед. 50% раствором NaOH, добавляют Al₂(SO₄)×18H₂O и FeCl₃ для коагуляции белков, фильтруют через фильтр-пресс. Раствор очищают на ионообменной смоле СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. В дальнейшем проводят еще ряд этапов химической очистки. Конечный препарат кристаллический. Однако используют в виде растворов, таблеток совместно с другими компонентами.

Перспективны исследования по мутагенезу пропионовокислых бактерий для создания высокопродуктивных штаммов, способных расти на дешевом непищевом сырье.

Для обогащения кисломолочных продуктов витамином В₁₂ используют чистые культуры пропионовокислых бактерий или в виде концентрата, приготовленного на основе молочной сыворотки.

Для животноводства витамин В₁₂ получают, используя культуры термофильных метаногенов при росте в среде, содержащей Н₂ и СО₂.

В Японии продемонстрирована возможность получения цианкобаламина с использованием иммобилизованных, измененных в результате мутаций и селективно отобранных клеток пропионовокислых бактерий, которые выделяют витамин в среду.

В настоящее время существует ряд других технологий получения витамина В₁₂ в нашей стране и за рубежом, но разбор их необходимо проводить в курсе основ биотехнологии витаминного производства.

Рибофлавин (син. витамин В₂)

Участвует в окислительно-восстановительных реакциях. Недостаток его в пище приводит к кожным заболеваниям, поражению глаз и т.д., недостаток в кормах вызывает замедление роста животных, нарушение белкового обмена. Его можно выделять из природного сырья. Достаточно много его в печени 1,6…1,3 мг%; в почках 1,6…2,1 мг%; мозг, желток яиц, шпинат, ржаная мука содержат в пределах 0,2…0,5 мг% (А.И.Колотилова, Е.П.Глушанков, 1976). Рекордсменом по синтезу этого витамина можно считать гриб Eremothecium ashbyii, который на 1 т питательной среды синтезирует 25 кг продукта. К такому же гиперпродуценту относят и гриб Ashbya gossypii. Среди бактерий гиперсинтетиком является Clostridium acetobutilicum.

В основе строения флавинов, к которым относится и витамин В₂, находится гетероциклическая изоаллоксазиновая система, представленная ароматическим (А), пиразиновым (В), пиримидиновым (С) конденсированными циклами. К азоту пиразинового кольца присоединен спирт рибит.

Коэнзимные формы рибофлавина (РФ) представляют собой фосфорные эфиры: флавиномононуклеотид (ФМН), флавинадениндинуклеотид (ФАД). Существуют биокаталитические факторы изоаллоксазиновой структуры, функциональными группами которых выступают РФ, ФМН, ФАД.

Помимо указанных выше организмов к суперпродуцентам рибофлавина относится Mycobacterium smegmatis, Mycocandida riboflavina, Candida flaveri и ряд других представителей.

Среды выращивания продуцентов содержат соевую муку, свекловичный сахар или пептон, свекловичный сахар, кукурузный экстракт, КН₂РО₄, MgSO₄. Время культивирования, включая все этапы, занимает 96…120 часов, температура культивирования 28…30⁰С, расход воздуха в ферментерах должен быть 1,5…2,0 л×мин^-1. Для получения кормовых препаратов суспензию концентрируют, затем высушивают в распылительной сушилке, при необходимости измельчают до состояния порошка, фасуют.

Повышение рентабельности производства требует усовершенствования процесса, осуществляемого в направлениях:

1) селекции мутантных штаммов;

2) оптимизации состава и удешевления сред;

3) оптимизации условий культивирования продуцента.

Потребность человека в витамине В₂ 2…2,5 мг/сут. Он поступает в организм с пищей (молоко, яичный желток, печень, дрожжи), а также в результате жизнедеятельности кишечной микрофлоры. В лечебной и профилактической медицине витамин В₂ применяют в виде моно- или комплексных препаратов при гиповитаминозах, инъекционным путем вводят ФМН и ФАД при патологиях, связанных с нарушением обмена флавиновых нуклеотидов. ФМН и ФАД применяют при лечении дистрофии сетчатки глаза, заболеваний печени, поджелудочной железы. Сложные эфиры рибофлавина обладают пролонгированным действием, они стимулируют углеводный и липидный обмен.

Витамином В₂ обогащают некоторые сорта белого хлеба. Его используют, окрашивая в оранжево-желтый цвет пищевые продукты.

Очень важна высокая обеспеченность кормов флавинами. Комбикорма должны содержать 5-6 г рибофлавина на тонну. Включение его в кормовой рацион обеспечивает нормальный рост животных, высокую яйценоскость кур, выживаемость цыплят.