Лабораторный диагноз

Лабораторные исследования для диагностики ВИЧ инфекции включают тесты на иммунодефицитность, а также специфические тесты на ВИЧ.

A. Иммунологические тесты. Следующие лабораторные показатели помогают устанавливать иммунодефицит при ВИЧ инфекции.

1. Общее количество лейкоцитов и лимфоцитов свидетельствует о лейкопении, и количество лимфоцитов обычно ниже 2 000 / мм³.

2. Исследование субпопуляций T лимфоцитов. Абсолютное содержание T4 клеток будет обычно меньше 200 / мм³. Сотношение T4 : T8 резко снижено.

3. Число тромбоцитов указывает на тромбоцитопению.

4. Повышенные уровни IgG и IgA.

5. Сниженный клеточный иммунитет, выявляемый кожными пробами.

6. Биопсия лимфоузлов обнаруживает глубокие аномалии.

B. Специфические тесты на ВИЧ инфекцию.Они включают выявление антигенов ВИЧ и антител к ним и выделение вируса.

1. Выявление антигена.Динамика появления обнаруживаемых антигенов и антител после ВИЧ инфекция в целом такова. После однократного массивного заражения, например при переливании крови, вирусные антигены (p24) могут быть обнаружены в крови примерно через две недели. IgM антитела появляются примерно через 4-6 недель, за ними следуют IgG антитела (рис. 2).

Рис. 2. Динамика маркеров ВИЧ

Если инфицирующая доза мала, например, после укола иглой, процесс может быть значительно отсрочен. Появление p24 антигенемии и вирусемии, сопровождаемой ранним гуморальным иммунным ответом совпадает с острым заболеванием или болезнью сероконверсии. Впоследствии p24 антиген исчезает из кровообращения и отсутствует в течение длительной бессимптомной стадии, вновь появляясь только в случае развития явного тяжелого заболевания. Тесты на определение антигена доступны только в специализированных лабораториях и поэтому обычно не используются.

2. Выделение вируса. После заражения человек остается инфицированным пожизненно. Вирус присутствует в токе крови и жидкостях организма, главным образом внутри лимфоцитов, но некоторые также и внеклеточно. Титры вируса высоки на ранних этапах инфекции примерно за неделю до начала появления антител. Антитела не нейтрализуют вирус, и они одновременно могут находиться в организме. Во время стадии бессимптомной инфекции титры вируса низкие и не могут быть обнаружены, но когда развивается клинически выраженный СПИД титры снова повышаются. Инфицированный человек поэтому может быть заразным все время, но инвазионная способность самая высокая в ранней стадии инфекции (когда тесты на антитела отрицательны и случай не может быть выявлен при скрининге) и снова, когда человек становится клинически больным.

Хотя вирус присутствует во многих местах организма, он наиболее легко выделяется из лимфоцитов периферической крови. Техника изоляции – кокультивирование лимфоцитов пациента с неинфицированными лимфоцитами в присутствии интерлейкина -2. Репликация вируса может быть обнаружена по активности обратной транскриптазы, а также по выявлению в системе вирусных антигенов. Однако, выделение вируса не является широко используемым тестом. Исследование может быть положительным только у части лиц, инфицированных ВИЧ. В связи с высоким риском заражения выделение вируса должно предприниматься только в лабораториях с соответствующим режимом.

3. Выявление антител. Обнаружение антител является самым простым и наиболее широко используемым методом для диагноза ВИЧ инфекции. Однако, необходимо подчеркнуть, что антитела могут появиться через несколько недель или месяцев после инфицирования, а человек может быть заразным уже в конце этого периода. Эта серонегативная стадия известна как период окна. Вследствие этого скрининг антител не вполне надежен для определения заразных лиц, например, из числа доноров. Было зарегистрирован много случаев передачи ВИЧ при переливании крови от серонегативных доноров. Установлено, что после полового контакта с ВИЧ-инфицированным антитела появляются, если имело место заражение, только через 2-6 месяцев. Поэтому тестирование антител через шесть месяцев может помочь установить инфицированность после однократного полового контакта с ВИЧ-инфицированным

После появления антител их титры возрастают и спектр расширяется в течение следующих нескольких месяцев. IgM антитела исчезают через 8-10 недель, в то время как IgG антитела остаются. Когда иммунодефицит становится тяжелым вследствие развития клинического СПИДа, некоторые компоненты анти-Вич антител могут исчезать (например, анти - p24).

Серологические тестына анти-ВИЧ антитела могут быть двух типов: скрининговые и подтверждающие тесты.

Скрининговые тесты обладают высокой чувствительностью, имеют широкий реакционный спектр, просты в постановке и могут быть автоматизированы для обработки больших количеств образцов одновременно. Они не являются высокоспецифичными и могут давать некоторое количество ложноположительных результатов. Все сыворотки, положительные в скрининговых тестах, прежде чем объявляться позитивными должны быть проверены подтверждающими тестами. Наиболее широко используемая проба для скринингового тестирования – ИФА.

ИФА. Прямой твердофазный метод ИФА - наиболее часто используемый метод. Антиген, полученный из ВИЧ, который выращивают на перевиваемой линии клеток Т-лимфоцитов или рекомбинантными методами, фиксируется в лунках микротитратора или другой подходящей твердой поверхности. Добавляют исследуемую сыворотку, и, если антитела присутствуют, они связываются с антигеном. После отмывания от несвязанной сыворотки добавляют античеловеческий иммуноглобулин, связанный с соответствующим ферментом, а затем – субстрат, изменяющий цвет при действии фермента. Если испытуемая сыворотка содержит анти- ВИЧ антитела, происходит видимое или обнаруживаемое фотометрически изменение цвета, которое может регистрироваться визуально или специальными ИФА-ридерами..

ИФА является простым и относительно недорогим методом, но ложноположительные реакции нередки, особенно с сыворотками, содержащими ревматоидный фактор или антилимфоцитарные антитела Сыворотки, хранящиеся длительное время, содержат неспецифические «липкие» иммуноглобулины. Плазма дает чаще ложноположительные результаты, чем сыворотка в реакции агглютинации. Лица из некоторых регионов мира могут обнаруживать неспецифические реакции за счет перекрестно реагирующих антител к распространенным в этой местности ретровирусам, не являющимся ВИЧ.

Более специфичны модификации ИФА, в которых антитела исследуемой сыворотки или конкурируют с конюгированным с ферментом анти- ВИЧ антителами, или фиксируются античеловеческим иммуноглобулином к твердой фазе. Доступно также обнаружение IgM антител методом ИФА.

Тест Карпаса – иммунопероксидазная реакция на стекле. Инфицированные ВИЧ клетки, прикрепленные к покрытой тефлоном лунке в предметном стекле, обрабатываются сначала исследуемой сывороткой, а затем с меченым пероксидазой хрена античеловеческим иммуноглобулином. Затем добавляют соответствующий субстрат, который дает цветную реакцию, если тест положительный. Тест прост и недорог, но оценка его субъективна.

Подтверждающим тестом, наиболее часто используемым, является иммуноблотинг (вестерн блот). В этом тесте белки ВИЧ, разделенные в соответствии с их электрофоретической подвижностью и молекулярной массой методом электрофореза в полиакриломидном геле, переносятся на нитроцеллюлозную мембрану. Такие полоски (стрипы) обрабатывают исследуемой сывороткой, а затем с меченым ферментом античеловеческим иммуноглобулином. Затем добавляют соответствующий субстрат, который дает видимую цветную полосу там, где специфическое антитело реагировало с разделенным вирусным белком. Положение полосы на стрипе указывает на антиген, с которым прореагировало антитело. В положительной сыворотке полосы будут обнаруживаться с многими белками, типично - с p24 (ген gag, капсидный белок), p31 (pol ген, обратная транскриптаза) и gp41, gpl20 или gpl60 (env ген, оболочечные антигены). Однако, интерпретация становится затруднительной, когда полосы появляются только в одном или двух местах, как например, с p24 или gpl20. Это может случаться на ранней стадии инфекции, но может также быть и неспецифиическим. Вестерн блот - очень полезный подтверждающий тест, но интерпретация его остается субъективной и требует значительного опыта. Неопределенные результаты нередки.

Положительный результат в любом скрининговом тесте не может быть принят без подтверждения. На практике для подтверждения использовался иммуноблотинг, который рассматривалося в качестве «золотого стандарта». Однако, поскольку тест громоздкий, дорогостоящий и труднодоступный, на практике в настоящее время требуется выполнение либо двух различных типов ИФА, либо ИФА с одним из быстрых тестов. Сыворотка, позитивная в обоих тестах рассматривается как положительная. В случае сомнения необходимо проведение повторного тестирования через 2-3 месяца.

Кроме постановки диагноза ВИЧ инфекции, лаборатория должна идентифицировать оппортунистические инфекции, которые являются характерными для СПИДА. Для этого достаточны обычные микробиологические исследования. Однако, серологическая диагностика оппортунистических инфекций не может быть всегда надеженой при СПИДЕ, поскольку образование антител может быть нарушено в связи с иммунодефицитностью.