Технология рекомбинантных ДНК

Рассмотрим типичную процедуру технологии рекомбинантной ДНК рис. 17.1).

1. Из организма – донора нужных генов – экстрагируют нативную ДНК (донорская ДНК, клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК). Эту ДНК подвергают ферментативному гидролизу и соединяют с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы. Для выделения фрагментов донорской и векторной ДНК используют одну и ту же рестриктазу, что и позволяет соединить эти фрагменты липкими концами. Образуется новая рекомбинантная молекула: конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК».

2. Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается по наследству при каждом делении. Этот процесс называется трансформацией.

3. Отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки).

4. Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Успех молекулярного клонирования зависит 1) от возможности воспроизводимо разрезать молекулу ДНК на фрагменты определенного размера и 2) способа их целенаправленного транспорта.

Донорская ДНК Клонируемый вектор-ДНК

↓ ↓

Ген Векторная ДНК

↓__________________________________________↓

↓

Рекомбинантная ДНК (ген+векторная ДНК)

↓

Встраивание рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина

↓

Отбор трансформированных клеток

↓

Экспрессия гена

↓

Выделение и очистка белка

Рис. 13.1. Схема технологии рекомбинантных ДНК

В настоящее время используется более 100 различных рекомбинантных белков (инсулин, соматотропин и др.).