Вводные понятия

Важнейшей проблемой генной инженерии является анализ естественных путей передачи генов между живыми организмами. Согласно А.В. Кузнецову и И.В. Кузнецовой (1998) к настоящему времени известно:

1. Обмен генами между клетками реализуется у прокариот.

2. Существует возможность переноса генов между симбиотическими организмами. Наиболее вероятен обмен генов между длительно контактирующими симбионтами или паразитами и хозяевами.

3. Перенос генов от бактерий к эукариотам постоянно происходит при передаче Ti-плазмиды от Agrobacterium tumefaciens в клетки растений-хозяев. Сегмент ДНК из Ti-плазмиды включается в геном растения, что вызывает изменение роста и дифференцировки клеток последнего.

4. У эукариот латеральный (горизонтальный) перенос генов, насколько сейчас известно, не происходит, хотя нельзя утверждать, что это правило абсолютно. Например, онкогенные вирусы, интегрированные в хромосому эукариотической клетки и оказавшиеся рядом с онкогеном, при выходе из этой клетки и повторном инфицировании способны захватить данный онкоген с собой и перенести в другой организм.

Считается, что в естественных условиях между видами животных (и растений) не происходит передачи генов, которые они приобрели в ходе эволюции, так как необходимые рекомбинации и мутации в обычных условиях происходят с низкой частотой. С развитием генной инженерии возможность включения чужеродной ДНК в геном реципиентных клеток доказана в многочисленных опытах по их трансформации (трансфекции, трансгенезу). Тот факт, что интродуцированная в клетку молекула ДНК может эффективно включаться в работу генома, по всей видимости, является общебиологическим феноменом (Kumar, 1996), на основе которого строится здание современной биотехнологии.

Сведения о латеральном переносе генов в природных сообществах прокариот немногочисленны. Гены могут переноситься в виде свободной ДНК, нехромосомных структур ДНК – плазмид и с помощью вирусов.

Прокариоты не способны осуществлять посттрансляционные модификации белка, свойственные эукариотам, поэтому их используют для синтеза простых белков. Дрожжи являются наиболее примитивными одноклеточными эукариотами, которые могут использоваться для направленного переноса генов и синтеза сложных белков.

Для точного расщепления ДНК используют бактериальные рестрицирующие эндонуклеазы типа II (рестриктазы). Например, одна из первых рестрицирующих эндонуклеаз II типа была выделена из бактерии
E. coli и получила название EcoRI. Этот фермент узнает участок ДНК, содержащий специфическую палиндромную последовательность (перевертыш типа «кок», «шалаш») G-A-A-T-T-C, и катализирует разрыв между остатками гуанина (G) и аденина (А) в каждой цепи. Происходит расщепление связи между атомом кислорода при 3'-атоме углерода дезоксирибозного остатка одного нуклеотида и фосфатной группой, присоединенной к 5'-углеродному атому дезоксирибозы соседнего нуклеотида. Разрывы в цепи ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате чего образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из четырех нуклеотидов в каждом (липкие концы). Каждый одноцепочечный «хвост» заканчивается 5'-фосфатной группой, а 3'-гидроксильная группа противоположной цепи как бы утоплена. К настоящему времени получены сотни рестриктаз; их номенклатура: род микроорганизма обозначается прописной буквой, а вид – двумя строчными, штамм обычно не указывается; римские цифры – порядковый номер данной эндонуклеазы в ряду прочих рестриктаз, выделенных из данного микроорганизма (см. выше EcoRI). Палиндромные последовательности, которые атакуют рестриктазы называют сайтами узнавания. Рестриктазы существут двух типов: 1) катализируют косое расщепление двойной спирали ДНК с образованием «липких концов» и 2) катализируют перпендикулярный разрыв с образованием «тупых концов».

Рестриктазы используют для 1) изучения последовательности нуклеотидов в ДНК и 2) в генной инженерии. В последнем случае рекомбинантные ДНК получают, когда два разных образца ДНК обрабатывают одной и той же рестриктазой с образованием фрагментов с липкими концами, а затем смешивают эти образцы. Благодаря комплементарному спариванию липких концов фрагментов разных образцов ДНК могут образовываться новые комбинации генов.

Плазмиды – это внехромосомные автономно реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК, содержащие от 1 до 500 т.п.н. Плазмиды встречаются практически у всех бактерий. Их делят на высококопийные (в клетке 10–100 копий) и низкокопийные (в клетке 1–4 копии). На долю плазмидной ДНК приходится 0,1–5,0% суммарной клеточной ДНК.

Для целей генной инженерии требуются плазмиды, обладающие тремя важными свойствами:

– небольшой размер (менее 15 т.п.н.), необходимый для эффективного переноса;

– наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка;

– наличие одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Природные (не модифицированные) плазмиды обычно лишены одного или нескольких свойств, необходимых для эффективного переноса, поэтому качественные плазмидные векторы приходится также создавать методами генетической инженерии.

В технологии рекомбинантных ДНК классическим является плазмидный вектор рВR322. Номенклатура: р – от английского plasmid, следующие буквы имеют отношение к описанию вектора или истории его создания (для данного вектора буквы BR указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Родригеса); цифра 322 – номер из исследовательского протокола. Размер плазмиды рВR322 – 4361 п.н. Плазмидный вектор несет два гена устойчивости к антибиотикам – ампициллину и тетрациклину, а также уникальные сайты узнавания ферментами рестрикции для BamHI, HindIII, SalI в гене Tet', один PstI-сайт в гене Amp', один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в бактериальных клетках кишечной палочки.

Введение рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина называется трансформацией. Положительный результат получается примерно в одной клетке из тысячи (введение в клетку плазмиды со встроенным фрагментом чужеродной ДНК – гибридная плазмида). Однако, проникновение в клетку экзогенной ДНК еще не означает, что она будет поддерживаться в клетке-хозяине. Для сохранения рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине в первоначальном виде необходимо отсутствие генов, кодирующих синтез рестриктаз, разрушающих ДНК.

Следующий этап – это идентификация клеток, содержащих рекомбинантную ДНК. Для этого используют введение переносимого гена в один из генов устойчивости к антибиотикам плазмиды и затем, высевая клетки на культуры с антибиотиками, отбирают трансформированные клетки.