Включение индивидуальных генов

Когда мы до сих пор говорили о начале функционирования ядер, или, конкретно, о начале синтеза РНК, речь, естественно, шла об одновременном включении сотен, если не тысяч генов, – включение одного или десяти генов мы просто бы не заметили. По‑видимому, в раннем развитии существует общий механизм, включающий одновременно транскрипцию сразу в очень многих точках хромосом. Однако должна существовать и другая регуляция, определяющая, почему в число этих тысяч генов попал именно данный ген, а не соседний. По другой развиваемой сейчас гипотезе, которую мы подробно обсудим в одной из последующих глав, включаются и работают, может быть, почти все гены, но некоторые из них транскрибируются намного интенсивнее, и, помимо этого, процессинг затрагивает только нужные про‑мРНК, а остальные разрушаются и даже не выходят из ядра. Пока же мы будем обсуждать эту проблему в «классических» представлениях о включении и выключении генов.

Включение отдельных (индивидуальных) генов происходит не только в раннем развитии, но и на всем протяжении клеточной дифференцировки. Этот процесс является одной из главных проблем и для молекулярной биологии, и для биологии развития. Хорошей моделью для его исследования может служить включение в эмбриональном развитии отдельных генов, кодирующих тот или иной фермент, о чем мы можем судить по появлению самого фермента.

Если этот фермент впервые появляется в развитии зародыша, то его появление, как правило, происходит лишь немногим позже включения соответствующего гена. Так, например, перед началом движений зародыша в нем начинается синтез холинэстеразы – фермента, важного для передачи на мышцу нервного импульса. До начала движений зародыша этого фермента почти нет. При дифференцировке поджелудочной железы в ней появляются отсутствующие до этого пищеварительные ферменты. У зародышей змей еще в яйце формируются ядовитые железы и в них начинают накапливаться особые ферменты змеиного ядра. В свежеотложенном яйце их, естественно, не было.

Хотя конкретные механизмы включения таких генов неизвестны, сам факт их включения на той, а не на другой стадии кажется достаточно понятным. Дифференцировка, например, поджелудочной железы на генетическом уровне и состоит в последовательном включении генов, сначала определяющих формообразование железы, а затем синтез в ней пищеварительных ферментов. В этом смысле менее понятно, а потому более интересно включение генов для тех ферментов, которые присутствуют во всех клетках и на всех стадиях развития.

Действительно, в каждой клетке имеется относительно немного видов особенных ферментов, характерных только для данного типа клеток. Известный биолог Эфрусси назвал такие белки белками «роскоши», имея в виду, что сама клетка могла бы без этих белков и обойтись. Ho вместе с тем в клетках присутствует большое количество (порядка тысячи) ферментов, необходимых всем видам клеток. Это так называемые «хаус‑кипинг»‑ферменты, т. е. ферменты «домашнего хозяйства». Они определяют и контролируют такие общеклеточные процессы, как дыхание и вообще энергетический обмен, проницаемость клеточных мембран, синтез белка и нуклеиновых кислот, образование различных биологически важных веществ и т. д. Естественно, что все эти «хаус‑кипинг»‑ферменты действуют и накапливаются в ооците, имеются в яйце и во всех клетках зародыша, присутствуют в тканях взрослого организма. Их концентрация и количественные соотношения могут меняться в зависимости от стадии развития и вида ткани, хотя в ходе раннего эмбриогенеза многие из них поддерживаются на довольно постоянном уровне.

Время жизни каждого вида фермента различно и варьирует от десятков минут до нескольких дней. Поэтому они должны почти все время синтезироваться для того, чтобы в клетке поддерживалось постоянное количество ферментных молекул. Для этого в клетке должны постоянно присутствовать мРНК для этих ферментов, а так как срок жизни мРНК также ограничен, то должны работать гены, пополняющие их количество.

Эта равновесная ситуация (транскрипция и распад мРНК, трансляция и распад ферментных белков) нарушается в яйце и в самом раннем эмбриональном развитии, когда работа генов прерывается, а зародыш содержит накопленный в оогенезе запас самих ферментных белков, а также мРНК для синтеза этих белков. Очевидно, что и эти ферменты и мРНК такие же, как в материнском организме, – ведь они были созданы благодаря активности генов ооцита. Неизвестно, содержатся ли в яйце мРНК для всех видов белков, присутствующих в яйце. Поэтому то или иное время эмбриональные клетки живут за счет накопленного фермента, причем его убыль может некоторое время пополняться благодаря трансляции на запасенной мРНК. Ho в какой‑то момент развития должны включиться собственные гены зародыша (на отцовской и материнской хромосомах) и появиться новосинтезированные мРНК, а на них должен начать транслироваться новый (точно такой же или аналогичный) фермент зародыша, который постепенно вытесняет чисто материнский фермент.

С чем связано включение генов данного «хаус‑киппинг»‑фермента на определенной стадии развития и какие механизмы это включение определяют? Это пока неясно, хотя для многих ферментов уже известно, когда в зародыше включаются гены, которые их контролируют. Судить о времени включения такого гена просто по проявлению ферментной активности нельзя, так как «хаус‑кипинг»‑фермент присутствует и активен на всех стадиях развития. О том, когда материнский фермент заменяется ферментом зародыша, можно судить по тому, когда впервые появляется отцовский фермент. Для этого можно использовать гибриды. У близких видов, которые хорошо скрещиваются, и даже у разных особей внутри вида одни и те же по названию и действию ферменты могут немного различаться.

Чаще всего материнский и отцовский ферменты различают по электрофоретической подвижности, т. е. по скорости движения молекул фермента в электрическом поле.

Оказалось, что многие ферменты присутствуют в клетках в нескольких похожих вариантах, их называют изоферментами и различают также по электрофоретической подвижности. Скрещивая два организма, отличающиеся по изоферментам, можно обнаружить, когда в ходе развития впервые появляется отцовский изофермент. Это означает, что включились и проявились отцовские гены данного фермента.

Скрещивание внутри одного вида и использование индивидуальных различий в изоферментах предпочтительны потому, что в этом случае есть уверенность, что оба гена – отцовский и материнский – включаются одновременно. Если же речь идет о межвидовых скрещиваниях или о более отдаленных гибридах, то полной уверенности в этом нет, так как у разных видов стадии, на которых включается тот или иной ген, могут несколько различаться.

Однако некоторые ферменты, принадлежащие к разным видам, электрофоретически не различаются. Многие ферменты трудно или даже невозможно подвергнуть электрофорезу или не удается потом выявить их место в геле с помощью цветной реакции, например такой важный митохондриальный фермент дыхания, как цитохромоксидаза. В составе митохондрий подвергнуть его электрофорезу, естественно, нельзя, а при выделении из них он сразу теряет активность. Для таких случаев в совместной работе нашей лаборатории биохимической эмбриологии (Москва, Институт биологии развития) и лаборатории сравнительной цитологии (Ленинград, Институт цитологии) было предложено использовать различия в теплоустойчивости ферментов.

Действительно, как показали ленинградские ученые В. Я. Александров и Б. П. Ушаков, у хладнокровных животных, обитающих в теплом климате, устойчивость белков к высоким температурам обычно оказывается выше, чем устойчивость аналогичных белков у видов, обитающих в холодном климате. Теплоустойчивость легко измерить, если образцы экстракта белков нагревать при разных температурах в течение определенного времени и потом смотреть процент активности фермента, которая после такого прогрева сохранилась. Температура, при которой сохраняется половина активности фермента, и есть показатель теплоустойчивости.

Первоначально нами совместно с А. А. Кусакиной (Ленинград) было показано, что один из ферментов углеводного обмена – альдолаза у вьюна имеет теплоустойчивость на 5–6° ниже, чем у тропических аквариумных рыб, которых можно скрещивать с вьюном (данио, барбус, разбора и др.). У гибрида вьюна (♀) с данио (♂) (яйца вьюна, сперма данио) на ранних стадиях теплоустойчивость альдолазы была такой же, как у вьюна. Так продолжалось до стадии 23 часа (появление зачатков первых органов), когда теплоустойчивость внезапно стала повышаться. В течение нескольких часов она поднялась на 2,5–3° и далее осталась на том же уровне. Это означало, что именно со стадии 23 часа начинается проявление отцовского гена альдолазы и в результате у гибридов возникает смесь двух ферментов – отцовского и материнского. Когда мы взяли реципрокных гибридных зародышей данио (♀) × вьюн (♂), их теплоустойчивость сначала была высокой, как у данио, а затем на той же стадии 23 часа стала снижаться и также достигла промежуточного значения.

В литературе накопилось довольно много данных о начале экспрессии генов, кодирующих различные ферменты. Такие данные получены в основном методом электрофореза на гибридах лягушек, двух видов форели, курицы и перепела и др. В нашей лаборатории при использовании обоих методов – по электрофоретической подвижности и по теплоустойчивости – на гибридах вьюна и других рыб получены данные о начале экспрессии генов, кодирующих несколько ферментов.

Оказалось, что ни у одного из исследованных нами ферментов гены не начинают проявлять свою активность тогда, когда начинается морфогенетическая функция генов, т. е. на стадии бластулы. Самое раннее проявление отцовских генов было обнаружено для цитохромоксидазы: повышение ее теплоустойчивости у гибридов вьюн × данио было замечено на стадии поздней гаструлы (14 ч развития при 21 °C). Однако некоторые гены, кодирующие такие важные ферменты, как глюкозо‑6‑фосфатдегидро‑ геназу или эстеразу, впервые начинают проявляться только в конце эмбрионального развития, а лактатдегидрогеназа еще позже – у ранней личинки.

Во многих случаях, хотя и не во всех, начало экспрессии генов совпадает с началом повышения общей активности фермента. Для эстеразы не только была обнаружена стадия, на которой начинается образование фермента, кодируемого генами зародыша, но и показано, как постепенно после этого исчезает материнский фермент. Однако почему одни ферменты начинают заменяться новыми, кодируемыми генами зародыша относительно рано, а другие – гораздо позже, остается непонятным.

Может быть, это связано со временем жизни самих белков и их мРНК, запасенных в оогенезе. Может быть, на той или иной стадии один изофермент должен заменяться другим. Может быть, быстрый рост отдельных органов зародыша требует соответствующего синтеза ферментов в клетках этого органа. Наконец, рост всего зародыша или личинки предполагает и увеличение количества фермента. Во всех этих случаях может оказаться необходимым появление нового фермента, а для этого необходимо включение собственных генов зародыша.

Подводя итог всей главе, можно сказать, что включение генетического аппарата на определенной стадии развития или включение отдельных генов требует участия специального механизма регуляции. В этом механизме должен быть какой‑то датчик стадии развития, запускающий всю цепь событий, в конце которой много генов или один из них начинает транскрибироваться.

В трех последовательных главах мы рассмотрели три «начала» развития – от начала оогенеза, от момента оплодотворения и от начала работы генов зародыша – и убедились, что существенно не то, что называть началом развития, а те последовательно наступающие процессы, которые и составляют раннее развитие. Все они проходят под генетическим контролем. Разница между ними лишь в том, чьи это гены и когда они функционируют. В оогенезе это непосредственный эффект действия материнских генов; при созревании яйца, при оплодотворении и на начальных стадиях развития это отдаленный эффект тех же материнских генов, но опосредованный через запасенные в оогенезе мРНК и белки. Наконец, все последующее развитие происходит снова под непосредственным контролем генов, но уже генов зародыша.