Методы определения белка
Цель работы: изучить методы исследования белка.
Определение массовой доли белков методом
формольного титрования
Аппаратура, реактивы и материалы. Пипетки простые вместимостью 20 и 50см3 и градуированные вместимостью 1 и 5см3; стаканы химические вместимостью 150-200 см3 , бюретка вместимостью 25см3 с ценой деления 0,1см3, снабжённая трубкой с натронной известью для защиты раствора гидроксида натрия от углекислого газа, и бюретка вместимостью 50см3 с ценой деления 0,1см3; резиновая груша; гидроксид натрия, ч.д.а. или х.ч. 0,1н и 40 %-ный растворы; раствор гидроксида натрия готовят на дистиллированной воде, свободной от диоксида углерода; спирт этиловый ректификованный или спирт синтетический; фенолфталеин (2 %-ный спиртовой раствор); формалин технический; 2,5 %-ный водный раствор сульфата кобальта ч. или ч.д.а., сульфит натрия ч.д.а. или ч.; 1 н раствор серной кислоты; вода дистиллированная, свободная от диоксида углерода.
Для определения содержания формальдегида в техническом формалине готовят раствор сульфита натрия: 126 г сульфита натрия кристаллического (Na2SO3 x 7H2O) или 63г безводного сульфита натрия (Na2SO3) растворяют в мерной колбе вместимостью 500см3 и объём доводят дистиллированной водой до метки.
Раствор сульфита натрия в количестве 50см3 нейтрализуют 1н. раствором серной кислоты в присутствии фенолфталеина до слабо-розовой окраски и добавляют точно 3см3 испытуемого формалина. Образовавшийся в результате реакции гидроксид натрия титруют 1 н. раствором серной кислоты до слабо-розовой окраски.
Количество 1 н. раствора серной кислоты (в см3), израсходованной на титрование образовавшегося гидроксида натрия, показывает количество формальдегида, содержащегося в 100см3 формалина (г/100см3). Для определения количества белка допускается применять формалин с содержанием формальдегида не менее 36г на 100см3. При наличии мути или осадка раствор формалина перед употреблением фильтруют.
Формалин перед употреблением нейтрализуют: к 50см3 формалина добавляют 3-4 капли 2 %-ного раствора фенолфталеина и затем по каплям приливают сначала 40 5-ный, а затем в конце 0,1 н раствор гидроксида натрия до появления слабо-розового окрашивания.
Формалин, оставшийся на следующий день, в случае необходимости дополнительно нейтрализуют 0,1н. раствором гидроксида натрия. Нейтрализация формалина, в котором образовался осадок, производится после фильтрования.
Для приготовления эталона окраски в химический стакан вместимостью 150-200см3 отмеривают пипеткой 20мл молока и добавляют 0,5мл 2,5 %-ного раствора сульфата кобальта. Эталон пригоден для работы в течении одной смены. Для лучшего сохранения к эталону можно добавить одну каплю формалина. Во избежание отстоя сливок эталон рекомендуется перемешивать.
Таблица 4.6 - Определение содержания белков в молоке при титровании проб в присутствии формалина
Количество 0,1н. раствора NaOH, см3 | Массовая доля белков в молоке, % | Количество 0,1н. раствора NaOH, см3 | Массовая доля белков в молоке, % |
2,45 2,5 2,55 2,6 2,65 2,7 2,75 2,8 2,85 2,9 2,95 3,05 3,1 3,15 3,2 3,25 | 2,35 2,4 2,44 2,49 2,54 2,59 2,64 2,69 2,73 2,78 2,83 2,88 2,93 2,98 3,03 3,07 3,12 | 3,3 3,35 3,4 3,45 3,5 3,55 3,6 3,65 3,7 3,75 3,8 3,85 3,9 3,95 4,05 4,1 | 3,16 3,21 3,25 3.31 3,35 3,4 3.45 3,5 3,55 3,6 3,65 3,69 3,74 3,79 3,84 3,89 3,94 |
Ход работы
В химический стакан вместимостью 150-200 см3 отмеривают с помощью пипетки 20 см3 молока и добавляют 0,25 см3 2 %-ного раствора гидроксида натрия до появления слабо-розового окрашивания, соответствующего окраски этанола. Затем в стакан вносят 4 см3 нейтрализованного 36-40 %-ного формалина, перемешивают круговыми движениями и через 1 мин вторично титруют до появления слабо-розового окрашивания.
Если испытания проводят при искусственном освещении, то для точного определения момента появления окраски используют белый экран , для чего лист чертёжной бумаги размером 40 х 40 см сгибают пополам.
Массовая доля (в %) общего количества белков в молоке равна количеству 0,1н. раствора гидроксида натрия, затраченного на нейтрализацию в присутствии формалина, умноженному на 0,959. Массовую долю общего белка в молоке можно определить также по таблице.
Колориметрический метод определения белка (по Лоури)
Аппаратура, реактивы и материалы: 1) 2 %-й раствор Na2СО3 в 0,1н NaОН; 2) раствор 0,5 % CuSO4 х 5Н2О в 1 %-м растворе двухзамещённого виннокислого натрия или калия; 3) опытный раствор: готовят смешивая 1-й и 2-й растворы (50 : 1 по объёму); реактив годен в течении дня; 4) реактив Фолина.
Приготовление реактива Фолина. Для стандартного раствора 100г вольфрамата натрия (Na2WO4 x 2H2O) и 25г молибдата натрия Na2МоО4 х 2H2O растворяют в 700см3 воды. К смеси добавляют 50см3 85 %-го раствора фосфорной и 100см3 соляной кислот (р = 1,19). Затем кипятят (не слишком сильно) 10 ч с обратным холодильником в вытяжном шкафу. После этого в колбу добавляют 150г сернокислого лития, 50 см3 воды и 5 капель бромной воды. Смесь кипятят в течении 15 мин в вытяжном шкафу для удаления избытка брома, после охлаждения доводят водой до 1дм3. Затем фильтруют и хранят в тёмной склянке с притёртой пробкой. Раствор должен быть ярко-жёлтого цвета. Обычно перед употреблением реактив Фолина разбавляют в 2 раза. Раствор можно хранить длительное время.
Ход работы
К 0,4см3 раствора белка добавляют 2см3 опытного раствора. Смесь перемешивают и через 10мин приливают к ней 0,2см3 рабочего раствора Фолина. Интенсивность окраски определяют на ФЭК-56М с красным светофильтром (или на спектрофотометре при 750 нм) через 30мин. Количество белка в растворе находят по калибровочной кривой.
Для построения калибровочной кривой 100 мг чистого белка (сывороточного γ – глобулина, кристаллического альбумина и др.) растворяют в 100см3 0,1н NaОН (1см3 содержит 1мг белка). В 9 мерных колб на 10см3 приливают раствор белка в возрастающих количествах: 0,5см3, а затем от 1 до 8см3. Раствор в колбах доводят водой до метки, перемешивают и из каждой колбы берут по 0,4см3 для определения белка по указанной прописи. По полученным данным вычерчивают калибровочную кривую.
Примечание. Определение белка данным методом в растительных объектах, содержащих фенолы, приводит к завышению результатов, так как они образуют аналогичную окраску с реактивами. Перед определением белка для удаления фенольных соединений необходима обработка ацетоном, охлаждённым до –10оС.
Определение белка колориметрическим методом
Аппаратура, реактивы и материалы.
В стеклянную пробирку помещают пипеткой 1см3 раствора молока, приливают 20см3 раствора красителя и, закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают её содержимое, переворачивая пробирку от 2 до 10 раз.
Следует избегать встряхивания, так как при этом образуется трудноразрушимая пена.
Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при частоте вращения 1000 об/мин в течении 20 мин.
Отбирают пипеткой 1см3 надосадочной жидкости, помещают в мерную колбу вместимостью 50см3, доливают колбу до метки водой и содержимое перемешивают. Аналогичным способом разбавляют раствор красителя в 50 раз.
Измеряют на фотоколориметре оптическую плотность разбавленного раствора красителя по отношению к разбавленному содержимому мерной колбы.
Массовую долю белка (Б), %, вычисляют по формуле:
Б=7,78Д-1,34, (4.6)
где Д – измеренная оптическая плотность, ед. оптической плотно-
сти;
7,78 – эмпирический коэффициент, % / ед. оптической плотно-
сти;
1,34 – эмпирический коэффициент, %.
Предел допустимой погрешности результата измерений составляет + 0,1 % массовой доли белка при доверительной вероятности 0,80 и расхождении между двумя параллельными измерениями не более 0,013 единиц оптической плотности или не более 0,1 % массовой доли белка.
За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов вычислений двух параллельных наблюдений, округляя результаты до второго десятичного знака.
Лабораторная работа № 6
Дата добавления: 2015-03-03; просмотров: 2919;