Проверка модели

Настоящая научная ценность модели измеряется тем, что можно на практике проверить все выводы, к которым она приводит. Модель Уотсона— Крика не только вобрала в себя все известные факты о ДНК и наследственности, но и позволила высказать ряд новых предположений.

Рассмотрим репликацию ДНК с общей точки зрения. Каждая цепь остается нетронутой, но две цепи одной молекулы расходятся, и к каждой старой цепи пристраивается новая. Это называется полуконсервативной репликацией ДНК, потому что вся родительская ДНК целиком не сохраняется, но остается каждая из ее цепей. Предположим, что начальная молекула окрашена в красный цвет, а новые нуклеотиды — в зеленый. Тогда после репликации каждая дочерняя молекула будет наполовину красной и наполовину зеленой. Если они снова подвергнутся репликации, то из получившихся молекул две по-прежнему будут наполовину красными и наполовину зелеными, а две — полностью зелеными. Обозначим изначальную молекулу сплошными линиями, а новые — прерывистыми. Получается следующая схема:

В 1954 году Мэтью Меселсон и Франклин Сталь из «Калтека» придумали способ проверить эти выводы. В совместной работе с Джеромом Виноградом они открыли, что густой раствор хлорида цезия (CsCl) при центрифугировании на большой скорости образует градиент плотности. Инструмент, называемый ультрацентрифуга, может развивать скорость до 60 тыс. оборотов в минуту, то есть до 1000 оборотов в секунду. Судя по тем относительно медленным центрифугам, которые бывают в парках развлечений, можно представить, какая центробежная сила образуется в мощной центрифуге! Под воздействием этой силы довольно тяжелые ионы цезия начинают перемещаться ко дну центрифужной пробирки. После нескольких часов центрифугирования в растворе CsCl образуется непрерывный градиент плотности, то есть ближе к дну плотность увеличивается, а к поверхности уменьшается. В таком растворе молекулы ДНК останавливаются в том месте раствора, плотность которого равна их плотности.

Меселсон и Сталь выращивали бактерии в среде с содержанием тяжелых изотопов азота (¹⁵N в отличие от обычного ¹⁴N). Клетки включали этот азот в свои ДНК, то есть их ДНК становились плотнее обычных ДНК. Таким образом, эти ДНК становились мечеными («красными» в нашем примере). Потом исследователи переносили бактерии в среду с обычной концентрацией азота, и поэтому все новые ДНК, образовавшиеся после этого, имели обычную плотность (в нашем примере «зеленые»). Через различные интервалы времени исследователи подвергали пробы ДНК центрифугированию в растворе CsCl и определяли их плотность (в ультрацентрифуге были оптическая система и фотокамера). Сначала все ДНК были плотными. После первого деления они стали наполовину плотными. После второго деления половина ДНК была наполовину плотной и половина ДНК была легкой. Именно так и должна была вести себя ДНК согласно модели Уотсона—Крика.

Второй вывод заключался в том, что при репликации ДНК должна наблюдаться «развилка». Две цепи не могут разделяться сразу по всей длине; они разрываются с какого-то конца, и к разъединившимся участкам пристраиваются новые цепи. Молекулы ДНК можно разглядеть при помощи авторадиографии — метода, при котором регистрируют распределение радиоактивных изотопов в молекуле. При этом часто используют тритий (³Н), изотоп водорода, потому что его атомы при распаде испускают электроны с малой энергией, которые легко поглощаются многими веществами. Если такой электрон попадает на фотографическую пленку или гель, то на ней остается темное пятно, указывающее на местоположение атома трития. Изображение, полученное от распада многих атомов, называется авторадиографией, потому что радиоактивное вещество как бы само себя фотографирует.

Авторадиографии ДНК получают, выращивая некоторые клетки (такие как бактерии или быстро растущие корни растений) в среде, содержащей тимидин (один из нуклеотидов ДНК с пиримидиновым основанием — тимин), помеченный тритием. Тритий, таким образом, включается во все вновь образующиеся ДНК. Затем материал тонким равномерным слоем располагают на пленке (корне растений, к примеру), тщательно раздавливают и распределяют. После промывки и удаления тимидина пленку покрывают фотоэмульсией и оставляют в темном месте, иногда на несколько месяцев. При проявлении эмульсии на пленке возникают темные зерна серебра в тех местах, где распадались атомы трития. Так на фотографии можно опознавать меченые клетки и их части.

В ряде опытов в среде с тритием выращивали бактерии Е. coli и после осторожно выделяли из них молекулы ДНК, растворяли их в воде, заставляя распрямляться на поверхности, и медленно осаждали раствор на фильтровальной бумаге. Такая техника показала, что молекула представляет собой кольцо с длиной окружности более 1 мм, то есть в тысячу раз больше клетки, в которой она обычно упакована. Хромосомы, как правило, оказывались в процессе репликации, и на авторадиографиях видны две точки ветвления, там, где ДНК-полимера-зы движутся в противоположных направлениях. Так модель Уотсона—Крика была подтверждена экспериментальными наблюдениями, хотя практика преподнесла и свои неожиданности.

Единственная хромосома Е. coli составляет весь без исключения геном этого организма. Это относительно маленький геном, хотя в нем и содержится около 3,8х10⁶ нуклеотидных пар. Следует, кстати, упомянуть о том, что молекулярные генетики часто не слишком аккуратно подходят к измерению молекул ДНК. Собственно говоря, основная единица — это нуклеотидная пара (н.п.), но ее отождествляют с основанием (базой) и измеряют длину ДНК в базах или килобазах (kb), то есть в тысячах баз, или нуклеотидных пар.

Глава восьмая СТРОЕНИЕ ГЕНА

Итак, мы уже знаем, что ген — это фрагмент ДНК, расположенный на хромосоме и определяющий структуру полипептидной цепи. В гене могут происходить мутации, и о том, что гены существуют, мы узнали во многом именно благодаря мутациям. Мутации часто приводят к потере фермента, поэтому мы знаем, что существуют нормальные гены и нормальные ферменты, а также то, что гены передают информацию о постройке ферментов следующему поколению организмов. Остается только выяснить, как устроены сами гены и как они функционируют. В этой главе мы покажем, как с помощью генетического анализа можно подробно изучить строение генов и понять, как с их помощью в клетке создаются белки.