Методы изучения чувствительности микробов к антибиотикам.

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам применяют три метода: диффузии препарата в агар из бумажных дисков, серийных разведений в бульоне и в плотной питательной среде. Имеются также ускоренные методы.

В качестве критерия чувствительности микробов к антибиотикам избирают их терапевтические концентрации в крови и других биотопах животного организма после введения определенных доз препарата Мерой чувствительности микробов является минимальная концентрация препарата (мкг/ед/мл), которая подавляет рост микробов на питательных средах в стандартных условиях постановки опыта (минимальная подавляющая концентрация - МПК).

Метод бумажных дисков Для его проведения нужны стандартные заводские диски, пропитанные антибиотиками в определённой концентрации, и стандартная питательная среда. Из суточной микробной культуры готовят взвесь на физрастворе (густота 1 млрд микробных тел в I мл), которую затем разводят в 10 раз. На поверхность плотной среды наливают 1-2 мл указанной культуры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности среды Остаток удаляют пипеткой. Среду подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность газона стерильным пинцетом накладывают диски (не более 6 на чашку) на расстоянии 2 см друг от друга и от краев чашки Инкубируют в термостате при 37°С - 24 часа

Учет: в падающем свете на фоне темной поверхности измеряют диаметр (с учетом диаметра диска) задержки роста. Оценку результатов проводят по специальной таблице путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны н таблице. Культуру относят к одной из трех категорий.

чувствительная, умеренно-чувствительная и устойчивая Укачанные категории предложены клинической химиотерапией, исходя из отношения между МПК и концентрацией препарата в крови при введении терапевтических доз. К чувствительным относят культуры, рост которых подавляется концентрациями препарата, создаваемыми в сыворотке крови больного в процессе назначения обычных доз антибиотика Умеренно-устойчивыми считаются культуры, подавляемые концентрациями, которые могут быть достигнуть при введении максимальных доз препарата. Устойчивые - культуры, рост которых не подавляется при введении даже максимально допустимых доз препарата.

Указанный метод является полу количественным. Для получения количественных результатов используют методы серийных разведений. Метод серийного разведения антибиотика в бульоне. Готовят ряд убывающих разведений антибиотика в пробирках с бульоном (кратные 2) и добавляют испытуемую культуру. Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотика Через сутки инкубации в термостате определяют МПК. которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста. Для определения бактерицидного действия из нескольких пробирок с задержкой роста делают высев петлей на сектора чашки Петри с МПА. За бактерицидную концентрацию принимают концентрацию препарата в последней пробирке, высев из которой не дал роста. Метод серийных разведений в плотной питательной Среде. Этот метод более чувствителен и точен. Каждый антибиотик испытывают в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в три чашки Петри (по одной чашке на каждую концентрацию). Контролем служит чашка с агаром без антибиотика. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотика 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет роста в термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет ни одной колонии. Микроорганизмы, рост которых подавлен всеми 3 концентрациями, рассматривают как чувствительные (в этом случае можно применять антибиотик в терапевтической дозе); 2-й и 3-й концентрациями как среднечувствительные (антибиотик можно применять только в увеличенной дозе); 3-й как умеренно-устойчивые микроорганизмы (антибиотик можно применять только местно); растущие на всех трех концентрациях, относят к устойчивым (антибиотик нельзя применять).

Ускоренные методы. Позволяют получить результат через 3-4 часа. Чаше всего пользуются методом. основанным на изменении окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) среды в процессе роста микроба в присутствии антибиотика

Ход работы: при использовании метода бумажных дисков или серийных разведений антибиотика в агаре через 4-6 часов роста культуры поверхность чашки обрабатывают индикатором, реагирующим на ОВП среды (тетразолий хлорид). В местах роста микроба среда окрашивается в красный цвет, при отсутствии роста микроба цвет среды не меняется. Учет и критерии оценки, как и при обычных методах. В последние годы разработана специальная тест-система ускоренного определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (посев тест-микроба в жидкую среду с антибиотиком, инкубация 4-6 часов с последующим определением прироста мутности раствора опытных образцов в сравнении с контрольными).

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Полуколичественный - диффузии в агар с применением бумажных дисков с антибиотиками. Учет -

диамметр зон задержки роста микроорганизмов вокруг диска. Оценка: устойчивость - отсутсвие зоны;

малая чувствительность - зона до 10 мм; чувствительность - зона более 10 мм Задача выбрать

эффективный аппарат.

Количественные:

а) разведение антибиотиков в мясо-пептонном бульоне;

б) разведение антибиотиков в мясо-пептонном агаре.

Учёт - наличие или отсутствие роста микробов в питательной среде с различными концентрациями препарата.

Оценка - минимальное количество препарата, подавляющее рост бактерий (мин в мкг'мм) Задача: позволяет рекомендовать эффект антибиотика и его дозу Ускоренный:

а) полуколичественный с дисками и индикаторами. Оценка - диаметр неокрашенных зон вокруг дисков

б) количественный разведение антибиотиков в МБП с углеводами и РН- индикаторами. Оценка- изменение цвета среды в пробирках