Генетические методы
Характеристика методов. Определяют генетические маркеры резистентности.
Особенности методов. Используют ПЦР, ПЦР-ПДРФ, ДНК-гибридизацию, секвенирование.
Техника проведения. Выделяют ДНК из материала от больных или из чистой культуры микроорганизмов. Проводят генетические исследования. Проводят сравнение с данными фенотипического анализа.
Принцип методов.У резистентных микроорганизмов присутствуют гены, контролирующие синтез ферментов, разрушающих антибиотики. У некоторых микроорганизмов резистентность связана с мутациями в генах, кодирующих структуры, на которые действует антибиотик. Изменение мишени приводит к резистентности (рис. 48).
Оценка чувствительности.Выявление у микроорганизма генетических маркеров резистентности свидетельствует о потенциальной устойчивости к антибиотику.
Оценка методов. Перспективны. На практике используются для диагностики антибиотикорезистентности микобактерий туберкулеза, а также для изучения генетических механизмов устойчивости в рамках регионального или национального мониторинга антибиотикорезистентности.
Рис. 48. Hain тест (реакция гибридизации на мембранах) для определения устойчивости к противотуберкулезным препаратам Mycobacterium spp. (на каждой тест-полоске верхние три горизонтальны полосы являются контролем, остальные свидетельствуют о видовой принадлежности и наличии мутаций в rpoB гене, обуславливающих устойчивость к рифампицину)
Выявление генетических маркёров резистентности целесообразно в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы определения чувствительности микроорганизмов неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулёзным препаратам с помощью культуральных методов занимает 4-8 нед. Кроме того, результаты фенотипических тестов могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов.
Факторы, влияющие на результаты определения антибиотикорезистентности:
1) состав питательной среды:
- содержание ионов Са2+ (не более 20-25 мг/л) и Mg2+ (не более 10-12,5 мг/л). Эти ионы инактивируют некоторые антибиотики (тетрациклины), при этом МИК антибиотика повышается;
- содержание тимина, тимидина, инактивирующих сульфаниламиды и триметоприм,
- рН среды (рис. 49).
Рис. 49. Влияние рН среды на диметры зон задержки роста некоторых антибиотиков
2) величина посевной дозы и состояние тест-микроорганизмов (инокулюм-эффект):
- культуры, длительное время хранившиеся на плотных или жидких питательных средах, обладают пониженными ростовыми свойствами, поэтому для оценки чувствительности необходимо использовать микроорганизмы, инкубировавшиеся не более 16-18 часов;
- увеличение концентрации инокулята с 105 КОЕ/мл до 107 КОЕ/мл может приводить к повышению МПК;
3) условия инкубации:
- изменение температуры инкубации может привести к торможению либо к увеличению скорости роста, поэтому посевы инкубируют при 350С;
- преждевременный или поздний учет результатов может привести к ошибочной оценке результатов, поэтому учёт проводят через 18-24 часа инкубации.
Причины несовпадений результатов определения активности препарата in vitro и его клинической эффективностью в лечении пациентов:
1) отсутствие адекватного хирургического лечения;
2) общее состояние пациента (возраст, питание, сопутствующие заболевания);
3) несвоевременное назначение антимикробной терапии;
4) низкая биодоступность препарата;
5) невозможность достижения бактерицидной концентрации в воспалительном очаге;
6) инактивация микробными ферментами.
Дата добавления: 2015-02-23; просмотров: 1172;