Определение активности липазы клещевины

Обмен липидов во всех организмах, состоит из процессов синтеза (анаболизма) и распада (катаболизма), у животных есть ещё процессы переваривания и всасывания липидов. Катаболизм и переваривание липидов начинаются с гидролиза при участии липаз.

Переваривание липидов происходит главным образом в тонком отделе кишечника, где при участии ферментов – липаз, фосфолипаз, холестеролэстеразы – они расщепляют на свои составные части: ацилглицеролы – на глицерин и жирные кислоты, фосфолипиды – на глицерин, жирные кислоты, фосфорную кислоту и азотистое основание, стероиды – на холестерин и жирную кислоту.

Продукты гидролиза липидов поступают в клетки стенки кишечника, где из них синтезируются липиды данного организма. Часть липидов может всасываться в кишечнике в виде тончайшей эмульсии без предварительного гидролиза. Из клеток кишечника липиды переходят в лимфатическую систему и частично в кровь, а затем в печень и другие органы, где они подвергаются разнообразным превращениям.

В процессе переработки и хранения пищевого сырья могут создаваться условия, увеличивающие активность липаз. Например, перекачивание, встряхивание и пастеризация молока активизируют липазу; освобождающиеся при гидролизе триацилглицеролов молочного жира низкомолекулярные жирные кислоты (масляная, капроновая, каприловая) придают такому молоку и продуктам из него прогорклый вкус и запах. Хранение некоторых видов муки и крупы, особенно содержащих много жира (пшено, овсяная мука и крупа), при повышенных температуре и влажности стимулирует гидролиз триглицеридов, что приводит к повышению кислотности продукта и его быстрому прогорканию. В семенах клещевины содержится значительное количество липазы. Этот фермент относится к классу гидролаз, подклассу эстераз, группы эстераз сложных эфиров карбоновых кислот (КФ 3.1.1.3). Липаза клещевины не растворяется в воде и проявляет активность в слабокислой среде при рН 4,8-5,0. Липазы легко и быстро отщепляют от молекулы триацилглицерола внешние остатки жирных кислот и в последнюю очередь – средний кислотный остаток: O

ïç

СН₂ -О-С-R₁ СН₂-ОН

O О + R₁-COOH

ïç 2 Н₂О ║

CH -O-C-R₂ ^ЛИПАЗА СН-О-С-R₂ + R₃-COOH

O Жирные кислоты

ïç

CH₂ -O-C-R₃ СН₂-ОН

Триацилглицерол Моноацилглицерол

ХОД РАБОТЫ. Берут две фарфоровые ступки (опыт и контроль). В опытной ступке тщательно растирают 1 г семени клещевины, очищенного от оболочки, и смешивают с 3 мл нейтрального масла, добавляют 2мл буферного раствора с рН 4,7 и оставляют на 30 мин при комнатной температуре для гидролиза. После этого в ступку добавляют 30 мл смеси спирта с эфиром в соотношении 1:1 и несколько капель раствора фенолфталеина, и оттитровывают отщепившиеся жирные кислоты раствором гидроксида калия с концентрацией 0,1 моль/л до слабо-розовой окраски, не исчезающей 30 сек.

В контрольной ступке тщательно растирают 1 г семени клещевины, добавляют 30 мл смеси спирта с эфиром, перемешивают, вносят 2 мл буферного раствора и 3 мл нейтрального масла, перемешивают и тут же добавляют 3-5 капель фенолфталеина и титруют раствором гидроксида калия с концентрацией 0,1 моль/л до слабо-розовой окраски, не исчезающей 30 сек. Контрольную пробу не подвергают инкубации.

Разница в объеме израсходованного на титрование гидроксида калия в опыте и контроле показывает активность липазы. Результаты определения записать в таблицу:

Таблица 18

Определение активности липазы клещевины

РЕАКТИВЫ. Смесь этанола с эфиром (1:1), семена клещевины очищенные, нейтральное растительное масло, растворы с массовой долей гидроксида калия 0,1 моль/л и фенолфталеина 1 % в этаноле.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Из каких процессов состоит обмен липидов в организме животных, растений и микроорганизмов?

2. С какого процесса начинается катаболизм и переваривание липидов?

3. Липазы пищевого сырья, их влияние на качество продукции.

4. К какому классу, подклассу и группе относятся липазы?

5. Напишите реакции катализируемые липазами.

6. Метод определения активности липаз.

7. Роль постановки контроля в определении активности липаз.