Результаты посева на среды Плоскирева, Эндо, МПА.

Микроорганизм	Количество колоний или степень интенсивности роста на средах
Плоскирева	Эндо	МПА
Кишечная палочка
Фекальный щелочеобразователь
Стафилококк
МПА	Среда Эндо
1. Escherichia coli; 2. Alcaligenes faecalis; 3. Staphylococcus

Бактериофагия. Генетика микроорганизмов. Мутации и рекомбинации.

1. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.

2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Грациа. Сущность этого метода состоит в следующем.1,5%-ный МПА с генцианвиолетом (0,1 мл 0,1% генционвиолета на 1 л среды), который добавляется для предохранения от загрязнения грамположительной воздушной микрофлорой, накануне опыта разли­вают по 25-30 мл в чашки Петри. Чашки хорошо просушивают в термостате или под бактерицидной лампой, после чего оставляют на ночь при комнатной температуре.

Перед опытом 0,7% МПА расплавляют и разливают по 2,5 мл в пробирки, охлаждают до 46-47^°С и затем добавляют в пробирки по 1 мл исследуемого фага (предварительно разведенного) и 0,1 мл эталонной культуры, все это быстро и тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями, после чего выливают в чашки на поверх­ность 1,5% агара. Смесь осторожными движениями распределяют так, чтобы над слоем 1,5% агара образовался слои 0,7% агара, содержащего бактериофаг и чувствительную к нему культуру бактерий. Для застывания добавленного агара чашки оставляют на столе на 1-1,5 часа, а затем помещают в термостат при 37^°С . Для получения четких результатов необходимо соблюдение следующих условий: а) чашки с 1,5% агаром должны быть хорошо высушены; б) чашки должны находиться после добавления 0,7% агара строго в горизонтальном положении во избежание стекания агара в одну сторону; в) расплавленный 0,7% агар после охлаждения до 46°С нельзя долго хранить, так как он может приобрести гелеобразную консистенцию.

Учет результатов титрования можно производить после 5-6-часо­вого инкубирования в термостате. Для этого подсчитывают количество колоний фага («стерильных» пятен) и умножают полученное число на фактор разведения. На­пример, при посеве 1 мл фага, разведенного в 10^-7 на чашке обнаружено 45 колоний, следовательно, титр фага равен 45×10⁷ = 4,5×10⁸ Зарисовать демонстрационный опыт титрования фага по Грациа.

Бактериофагия на плотной ПС («стерильные» пятна)	Титрование фага по методу агаровых слоёв (по Грациа)

3. а) Опыт трансдукции.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиента Е. соli 1ас^- добавляют в таком же количестве трансдуцирующий фаг, выделенный из культуры Е. соli 1ас⁺, в концентрации 10⁶-10⁷ . Смесь инкубируют при 37^°С в течение часа, после чего 0,1 мл высевают на среду Эндо. В качестве контроля на среду Эндо высевают также культуру Е.соli lас⁺ (реципиент без фага). Посевы ставят на сутки в термостат. Учет результатов производят по числу выросших окрашенных колоний.

б) Опыт конъюгации.

Сущность опыта заключается в том, что от донорных клеток путем конъюгации передаются гены, контролирующие способность синтезировать треонин и лейцин, клеткам-реципиентам, ауксотрофным по этим аминокислотам.

В качестве донора используется культура Е. coli Hfr с генотипом tre⁺, lei⁺, met^-, str^s (str^s – чувствительность к стрептомицину). Реципиентом служит культура Е. coli F^– с генотипом tre^-, lei^-, met⁺, str^r (str^r - устойчивость к стрептомицину) .

Для выделения рекомбинантов используют солевую среду М-9 со стрептомицином, содержащую глюкозы 1,0 г; стрептомицина – 200 ед/мл; NH₄Cl – 1,0 г; NaС1 – 0,5 г; Na₂HРO₄ – 6,0 г; КH₂PO₄ – 3,0 г; Mg₂SO₄ – 0,2 г; дистиллированной воды – 1,0 л. Для тех же целей может быть испо­льзована плотная среда. В этом случае к указанному составу добавля­ется 20,0 г агар-агара.

На этой среде могут расти только рекомбинанты (трансконъюганты). Культуры донорного и реципиентного штаммов не растут на данной среде, так как первая ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а вторая ауксотрофна по треонину и лейцину.

Постановка опыта: к 2 мл 3-часовой бульонной культуры реципиен­та добавляют 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора. Смесь инкубируют в течение 30 минут при 37°С. Затем смесь разводят в 100 и 1000 раз и засевают разведения в объеме 0,1 мл на селективную среду для выделения рекомбинантов. В качестве контроля на такую же среду засевают культуры донора и реципиента в том же объеме. На следующие сутки регистрируют результаты опыта. В пробирках с посевом рекомбинанта наблюдается помутнение среды. В средах с посевами донорной и реципиентной культур роста нет. Аналогичным образом регистрируют результаты посевов на плотных средах.

Просмотреть посевы культур донора, реципиента и рекомбинантов на минимальной среде со стрептомицином. Обратить внимание на рост культуры рекомбинантов. Культуры донора и реципиента не растут на данной среде, так как культура донора ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а культура реципиента ауксотрофна по треонину и лейцину.