Методические указания.

Микрофлора воздуха

ЛЕКЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ

Воздух является неблагоприятной средой для развития микроорганизмов. В нем нет питательных веществ и других условий, необходимых для их жизни.

Микрофлору атмосферного воздуха можно условно разделить на резидентную (постоянно обнаруживаемую) и временную (обнаруживаемую спорадически).

Резидентная (постоянная) микрофлора атмосферного воздуха формируется в основном при попадании микроорганизмов вместе с пылью и капельками влаги из почвы и воды, с поверхности растений. Микроорганизмы, постоянно присутствующие в воздухе, отличаются большой устойчивостью к неблагоприятным факторам внешней среды. В воздухе обнаружено до ста различных видов сапрофитных микроорганизмов, но в основном встречаются три группы:

§ Устойчивые к высыханию пигментообразующие кокки - микрококки (М. roseus, М. luteus), сарцины (S. maxima). В солнечные дни они составляют до 70-80% всей флоры (пигмент защищает бактерии от инсоляции).

§ Почвенные споровые и гнилостные микроорганизмы - сенная, картофельная, капустная палочки (Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Вас. mycoides) и т.д. Их содержание резко увеличивается в сухую и ветреную погоду.

§ Актиномицеты, плесневые и дрожжевые грибы родов Penicillium, Aspergillus, Mucor, Candida и другие. Их содержание увеличивается при повышении влажности воздуха.

Временная микрофлора атмосферного воздуха в основном также формируется за счет микроорганизмов почвы и воды (при испарении воды с поверхности водоемов). Микроорганизмы могут попадать в атмосферный воздух при работе сельскохозяйственных, мясоперерабатывающих, фармацевтических предприятий, предприятий микробиологической промышленности.

Количественный и видовой состав микрофлоры воздуха зависит от ряда факторов (климатических, метеорологических, сезонных, общего санитарного состояния местности и др). Воздух наиболее загрязнен микроорганизмами вблизи земной поверхности, а с высотой их количество резко снижается. Наибольшая высота, на которой были обнаружены споры бацилл и плесневых грибов - 84 км над уровнем моря (Жарикова Г.Г., 2005).

В больших городах содержание микроорганизмов в атмосферном воздухе достигает 4000 -10000 клеток в 1 м³ на высоте 2-3 м от поверхности. Самый чистый воздух - в районе полюсов, над лесными массивами, морями, горами. Так, в 1 м³ воздуха над морем или тайгой содержатся единицы микробных клеток.

Пыль сорбирует микроорганизмы; между запыленностью и микробной обсемененностью воздуха существует прямая зависимость.

Атмосферный воздух способен к самоочищению. К механизмам самоочищения атмосферного воздуха относится оседание бактериальных аэрозолей под воздействием гравитации. Губительно воздействует на микроорганизмы солнечный свет, но бактерицидное действие солнечных лучей обратно пропорционально степени запылённости воздуха. Важным фактором самоочищения является постоянное перемешивание воздушных потоков. Способствует самоочищению повышенная влажность воздуха. Атмосфера значительно очищается от бактерий после дождя или снегопада. Осевшие на землю или другие поверхности микроорганизмы соединяются с пылевыми и почвенными частицами.

Воздух закрытых помещений значительно отличается по составу и количеству микроорганизмов от атмосферного. Бактериальная обсеменённость воздуха закрытых помещений всегда выше. Среди микроорганизмов доминируют обитатели носоглотки и кожи человека и животных, в том числе патогенные виды, попадающие в воздух при дыхании, кашле, чихании или разговоре. В животноводческих помещениях воздушная среда загрязняется микробами при раздаче кормов, особенно грубых, при перегруппировке животных, их чистке, уборке навоза.

Находящиеся в мокроте и слизи, а также в частицах слущенного эпидермиса микроорганизмы окружены белковым субстратом. Когда такие капельки высыхают, то белковая пленка оказывает защитное действие; микроорганизмы долгое время сохраняются, выживают и могут переноситься с воздушными потоками на большие расстояния (до 30 км).

Выделяют три основные фазы бактериального аэрозоля. Капельная, или крупноядерная фаза состоит из бактериальных клеток, окружённых водно-солевой оболочкой. Мелкоядерная фаза образуется при высыхании частиц первой фазы и состоит из бактериальных клеток, сохранивших только химически связанную воду на своей поверхности и свободную воду внутри клеток. Из первых двух фаз бактерии могут переходить в состав более крупных частиц, оседающих в виде пыли на различных предметах, образуя так называемую «бактериальную пыль». Эта фаза бактериального аэрозоля преобладает в воздухе жилых помещений и с ней рассеиваются патогенные микроорганизмы, устойчивые к высушиванию (микобактерии, клостридии, стафилококки, стрептококки, грибы).

Обсемененность воздуха в животноводческих помещениях зависит от санитарно-гигиенического состояния, плотности размещения животных, качества подстилки и других факторов. Так, в 1 м³ воздуха в коровниках содержание микроорганизмов может достигать 12000-86000; в свинарниках - 25000-67000; в птичниках - 30000-120000. При этом резко увеличивается содержание в воздухе стафилококков, зеленящих и гемолитических стрептококков, бактерий группы кишечной палочки, синегнойной палочки, дифтероидов, микобактерий, спор гнилостных почвенных микроорганизмов, плесневых и дрожжевых грибов.

В помещениях цехов предприятий мясной и молочной промышленности микроорганизмы попадают в воздух с рабочих поверхностей, оборудования, кожи и содержимого кишечника убойных животных, мяса и мясопродуктов, молока и молочных продуктов, а также из отходов производства, оук и спецодежды персонала. В 1 м³ воздуха убойного цеха может быть более 1 млн бактерий. В течение дня в цехе убоя и первичной переработки животных количество микроорганизмов изменяется, в конце рабочей смены увеличивается в несколько десятков раз.

Воздушно-капельным и воздушно-пылевым путями может происходить заражение человека и животных возбудителями многих бактериальных и вирусных болезней: стафилококкозов и стрептококкозов, синегнойной инфекции, дифтерита, чумы, туберкулеза, туляремии, пастереллеза, сибирской язвы, хламидиозов, микоплазмозов, гриппа, ящура, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, инфекционного бронхита и инфекционного ларинготрахеита кур и т.д.

Степень загрязнения воздуха микроорганизмами зависит от качества вентиляции, конструкции помещений, освещенности, влажности, температуры воздуха, санитарного состояния производственных помещений и других факторов. Наличие повышенной температуры, влажности, сильной запыленности воздуха, отсутствие УФ-лучей, сосредоточение большого числа людей и животных в ограниченном помещении приводит к тому, что микроорганизмы пассируются, их вирулентные свойства усиливаются. При наличии возбудителей инфекционных болезней в воздухе помещения создается угроза заражения всей группы людей (поголовья животных). Если же отсутствуют истинные возбудители, но существует высокая микробная контаминация воздуха условно - патогенными и непатогенными микроорганизмами, то возможно микробное давление на макроорганизм, то есть у людей и животных возникает стрессовое состояние. При интенсивных методах содержания и кормления животных в животноводческих помещениях могут возникать болезни со сложной этиологией, неясно выраженными симптомокомплексами, охватывающие все поголовье. Это обусловлено явлением, именуемым местным микробизмом (По Кузнецову Л.Ф. и соавт., 2001). Местный микробизм - это совокупность условий, способствующих проникновению в данную среду микробов, их сохранению, размножению и изменчивости.

Способы очистки и обеззараживания воздуха закрытых помещений можно разделить на физические и химические.

К физическим способам очистки и обеззараживания воздуха относятся вентиляция, фильтрация, ультрафиолетовое облучение. Вентиляция — высокоэффективный способ снижения микробного обсеменения воздуха. Загрязненный воздух удаляется из помещений, а на его место поступает более чистый воздух из атмосферы. Очистка поступающего воздуха путем фильтрации повышает эффективность вентиляции. Фильтры, пропитанные специальной пылесвязывающей жидкостью, задерживают до 90-95% микробов и частиц пыли, содержащихся в воздухе. Губительно действует на микроорганизмы свет. Наибольшей бактерицидностью обладают лучи с короткой волной и сильным фотохимическим действием (ультрафиолетовая часть спектра). Высокое бактерицидное действие ультрафиолетовых лучей широко используют для обеззараживания воздуха производственных цехов, холодильных камер на предприятиях мясной, молочной, биологической и бродильной промышленности, для стерилизации воздуха в операционных, боксах и других больничных помещениях. Для этого применяют бактерицидные ультрафиолетовые лампы (БУВ) разной мощности.

В качестве химического способа очистки воздуха от микроорганизмов, главным образом патогенных, используют обработку аэрозолями различных дезинфицирующих средств. Для обеззараживания помещений (в отсутствии людей и животных) из дезинфицирующих средств в форме аэрозоля применяют 37%-ные растворы формальдегида, 20%-ный раствор параформа с добавлением 1 % едкой щелочи, 24 %-ный раствор глутарового альдегида, 30 %- ный раствор алкамона и т.д.

Санитарно-микробиологические исследования воздуха

При санитарно-микробиологических исследованиях воздух оценивают по следующим показателям:

1. общее микробное число (ОМЧ) - общее количество бактерий и грибов в 1 м³ воздуха;

2. наличие санитарно-показательных микроорганизмов (СПМО):

§ Staphylococcus aureus,

§ гемолитических стрептококков;

3. наличие патогенных микроорганизмов (по показаниям): плесневых грибов, микобактерий туберкулеза, синегнойной палочки и т.д.

В некоторых случаях в воздухе определяют присутствие бактерий группы кишечной палочки (БГКП).

На предприятиях микробиологической промышленности проводят исследование на наличие микроорганизмов-продуцентов (Aspergillus и споровые бактерии - на ферментных заводах, Candida на гидролизно-дрожжевых заводах и заводах по производству БВК, Pseudomonas fluorescens при производстве витаминов группы «В»; сальмонелл и Bacillus thuringiensis - при производстве бактериальных средств защиты растений и борьбы с грызунами и т.д.).

Нормативные показатели ОМЧ закреплены в соответствующих ГОСТ. Так в операционных, родильных залах, боксах бактериологических лабораторий и других помещениях класса А (особо чистых) до начала и во время работы ОМЧ должно быть не более 200 КОЕ/м³ при отсутствии Staphylococcus aureus, плесневых и дрожжевых грибов. В помещениях, предназначенных для повседневного проживания людей, санитарное состояние воздуха оценивается при летнем режиме (среднесуточная температура атмосферного воздуха равна и более 10°С) и при зимнем режиме. При летнем режиме воздух считается чистым при общем количестве микроорганизмов в 1500 КОЕ в 1 м³, при зимнем режиме - при ОМЧ - 4500 КОЕ в 1 м³. В производственных помещениях предприятий пищевой промышленности воздух считается загрязненным при содержании 500-1000 бактерий в 1 м³.

Наличие стафилококков, α и β-гемолитических стрептококков является свидетельством воздушно-капельного загрязнения воздуха микрофлорой верхних дыхательных путей в присутствии большого количества или при длительном пребывании людей и животных.

Присутствие спорообразующих палочек является показателем запылённости и отсутствия влажной уборки.

Выявление плесневых грибов указывает на повышенную влажность.

Косвенным показателем плохой освещённости служит отсутствие пигментообразующих бактерий.

Для взятия проб воздуха разработаны следующие методы.

Седиментационный метод (метод оседания) по Коху.

Метод седиментации (оседания) предложенный Робертом Кохом, наиболее простой и доступный, но наименее точный. Он пригоден только для работы внутри помещений. Чашки Петри с питательной средой оставляют открытыми в помещении на определенное время, располагая их на высоте «рабочей зоны», то есть на поверхности рабочих столов, конвейеров, кормушек, на уровне головы животных в стойлах и т.д. Затем чашки закрывают крышками и ставят в термостат при 37±1°С на 24 часа. По количеству выросших колоний судят о степени загрязнения воздуха микроорганизмами.

Время экспозиции чашек с питательной средой зависит от того, насколько, предположительно, загрязнен воздух данного помещения микроорганизмами.

Для подсчета ОМЧ в воздухе в качестве питательной среды чаще всего используют универсальную питательную среду: мясо-пептонный агар (МПА). Для определения ОМЧ в помещениях седиментационным методом по Коху чашки с МПА обычно выдерживают в открытом виде 10-30 мин.

Для выявления стафилококков используют чашки с желточно-солевым агаром, их выдерживают 15 мин. Для выявления зеленящих и бета-гемолитических стрептококков посев производят на кровяной агар. Для выявления энтеробактерий применяют чашки со средой Левина. После отбора проб чашки с питательными средами помещают в термостат при температуре 37-38°С на 18-24 ч.

Для выявления дрожжей и плесневых грибов используют среду Сабуро; посевы культивируют 3-5 суток при температуре 20-22°С.

Подсчитывают суммарное количество колоний, выросших на обеих чашках.

Косвенно можно вычислить количество микробов в 1 м³ воздуха, исходя из экспериментальных данных в.Л.Омелянского, установившего. Что на поверхности питательной среды площадью 10 см² за 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха, а в 1 м³ в 100 раз больше.

Аспирационный метод

Аспирационный метод - это более точный метод по сравнению с седиментационным. При использовании этого метода воздух приводят в движение различными способами, а на пути воздушной струи помещают плотную питательную среду. Сталкиваясь со средой, бактериальные аэрозоли оседают на ней.

В настоящее время при санитарно-бактериологическом контроле воздушной среды для отбора проб воздуха применяют отечественные пробоотборные устройства (ПУ) нескольких технологических марок, таких как аппарат Кротова, ПУ-1Б, МБ . Во всех этих устройствах используется принцип импакционного (то есть ударного, от англ. impact) осаждения пылевых частиц на плотную питательную среду.

Аппарат Кротова представляет собой металлический цилиндр, внутри которого находится электромотор с центробежным вентилятором и вращающимся диском-подставкой для чашки Петри с плотной питательной средой (МПА, глюкозо-кровяной агар, желточно-солевой агар и т.п.). В крышке цилиндра имеется клиновидная щель, через которую всасывается воздух. Его количество определяют с помощью ротометра. Для определения общего микробного числа воздуха помещения через прибор пропускают 100 л воздуха: для обнаружения стафилококков и других патогенных микробов объем исследуемого воздуха увеличивают до 250 л. Отбор проб воздуха в жилых и производственных помещениях производят на высоте рабочего стола, в животноводческих помещениях - на уровне кормушек.

Содержание микробов в 1 л воздуха определяют делением числа выросших колоний на количество литров пропущенного воздуха. Чтобы перевести этот показатель из расчета на 1м³ полученное число микробов в 1 л воздуха умножают на 1000.

Осаждение бактериальных аэрозолей воздуха электростатическими силами осуществляют при помощи пробоотборника аэрозольного бактериологического ПАБ-1 и ПАБ-2. Приборы работают по принципу электростатического осаждения частиц аэрозоля из потока воздуха. Частицы исследуемого воздуха электризуются и осаждаются на электрод противоположного знака.

Осаждение микробных аэрозолей паром или распыленной жидкостью может быть проведено с помощью импинджеров и сифонирующих приборов с жидкостью (МПБ, пептонная вода, изотонический раствор NaCl), через которые барбатируется (пропускается, просасывается) исследуемый воздух. Капиллярные трубки, имеющиеся в таких приборах, образуют пульверизатор. При прохождении воздуха через прибор улавливающая жидкость, встречаясь с воздушной струёй, превращается в аэрозоль и адсорбирует микробные частицы из воздуха. Затем жидкость стекает в специальный резервуар и может быть использована для последующего цикла. Жидкость из импинджеров и сифонирующих приборов после просасывания определенного количества воздуха исследуют бактериологическими и вирусологическими методами.

Фильтрационный метод

Фильтрация воздуха может производиться через жидкости, твёрдые нерастворимые фильтры и твёрдые растворимые фильтры.

Фильтрация воздуха через жидкость, в том числе с использованием прибора Дьяконова, основана на том, что определенный объем воздуха (10-20 л) пропускают при частом встряхивании через «склянки Дрекселя» - стеклянный цилиндр с 20 мл стерильного физиологического раствора или стерильной питательной среды (МПБ) и стеклянными бусами. С помощью приводящей и отводящей стеклянных трубок через прибор просасывают 100 л воздуха. Для лучшего раздробления частиц пыли и разделения скопления микробов на них жидкость тщательно перемешивают. Затем по 1 см³ среды выливают в 2-3 стерильные чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным до 40-45°С мясо-пептонным агаром (МПА) или специальной питательной средой, равномерно распределяют вращательными движениями по дну чашки и оставляют до застывания среды. Чашки вверх дном помещают в термостат на 24-48 ч при температуре 37-38°С. Подсчитывают количество выросших колоний и, производя пересчет на 1 м³, вычисляют количество микроорганизмов в 1 м³ исследованного воздуха.

Фильтрация воздуха через нерастворимые твёрдые фильтры проводится с применением фильтров из хлопчатобумажной или тонкой стеклянной ваты. Непосредственно перед работой фильтр пропитывают стерильной смесью, приготовленной из равных объёмов вазелинового масла и 3%-го раствора желатина. Фильтр вставляют в бактериоуловители соответствующего прибора и пропускают через него при помощи аспиратора 100-300 л воздуха. Осадок извлекается промыванием фильтра физиологическим раствором с последующим анализом этого раствора на питательных средах.

Использовать для улавливания микроорганизмов растворимые твёрдые фильтры из морской соли впервые предложил Луи Пастер. Можно использовать растворяемые затем в пептонной воде и МПБ твёрдые фильтры, изготовленные из желатиновой пены и других веществ. При проведении отбора проб воздуха стерильные желатиновые фильтры фиксируют в аппарате Зейтца, к которому присоединяют вакуум-насос и просасывают определённый объём воздуха.

Практическая работа:

1. Освоить методику определения микробного загрязнения воздуха в различных помещениях седиментационным методом и с помощью аппарата Кротова.

2. Подсчитать количество микроорганизмов в воздухе, используя чашки с МПА с ростом воздушной микрофлоры.

3. Изучить и описать колонии микроорганизмов, выделенных из воздуха помещений. Сделать мазки из таких колоний, окрасить по Граму, провести микроскопию мазков.

Контрольные вопросы:

1. Какие микроорганизмы постоянно присутствуют в воздухе?

2. Какие адаптационные механизмы помогают микроорганизмам выживать в воздухе.

3. Какие болезни могут передаваться воздушно-капельным и воздушным путем?

4. Какими путями происходит загрязнение воздуха жилых, животноводческих и производственных помещений, от чего зависит интенсивность загрязнения?

5. По каким показателям оценивают степень загрязнения воздуха?

6. Какими методами проводят санитарно-бактериологическое исследование воздуха?

7. В чем суть экспериментальных данных Омелянского, как их используют на практике?

8. Расскажите о принципе работы прибора Кротова.

9. Объясните значение терминов: «импакционное осаждение», «импинджеры», «барбатироваться», «каскадные импакторы».