Иммуноферментный анализ (ИФА)

В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ).

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (рис.35), непрямой и конкурентные способы (рис.36).

Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре (ИФА – анализаторе).

К преимуществам ИФА следует отнести:

- простота методов оценки реакции;

- стабильность конъюгатов;

- легко поддаётся автоматизации.

В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:

А) конкурентный тип

Предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определения носительства HBs Ag.

Компоненты:

1) исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;

2) антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;

3) конъюгат – мышиные моноклональные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой;

4) ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат;

5) фосфатно – солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

- положительная (сыворотка с HBs Ag);

- отрицательная (сыворотка без HBs Ag).

Ход работы:

1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2. Инкубация 1 час при 37°С.

3. Отмывание лунок.

4. Внесение конъюгата.

5. Инкубация 1 час при 37°С.

6. Отмывание лунок.

7. Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.

8. Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.

Реакция протекает в три фазы:

1. HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).

2. Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ - HBs Ag - anti HBs АТ, меченые пероксидазой).

3. ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

В) непрямой тип

Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ – инфекции.

Цель: Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции – обнаружение антител к антигенам ВИЧ.

Компоненты:

1) исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ);

2) синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;

3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ);

4) ОФД;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

- положительная;

- отрицательная.

Ход работы:

1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2. Инкубация 30 минут при 37°С.

3. Отмывание.

4. Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом.

5. Инкубация 30 минут при 37°С.

6. Отмывание.

7. Внесение ОФД.

Реакция протекает в 3 фазы:

1. Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ ( АГ ВИЧ - АТ к ВИЧ).

2. Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.

3. ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.