Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

В основе ПЦР (метода амплификации ДНК in vitro) лежит способность однонитчатой ДНК (праймера) достраиваться и взаимодействовать по принципу комплементарности с ДНК искомого возбудителя при ее наличии в исследуемом материале.

Компоненты реакции:

1) исследуемый материал, содержащий молекулу ДНК микроорганизмов (испражнение, мокрота, выделенная чистая культура микроба и др.);

2) праймеры – короткие искусственно синтезированные молекулы ДНК, идентичные соответствующим участкам определяемой ДНК микроба;

3) фермент (ДНК- полимераза), обеспечивающий достраивание второй цепи ДНК;

4) смесь нуклеотидов – строительный материал, из которого синтезируется достраиваемая ферментом цепь ДНК;

Каждый цикл амплификации состоит из 3-х этапов:

1) денатурация ДНК, находящуюся в образце. Для этого нагревают реакционную смесь при t 93-95⁰ С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных;

2) отжиг – присоединение праймеров и ДНК микроба, что происходит в соответствии с правилами комплементарности при t 50-65°C.

3) элонгация– синтез второй цепи ДНК при участии полимеразы при t 72°C (рис.22).

В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются. На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК определяемого микроба удваивается. Благодаря этому происходит многократное удвоение специфических фрагментов ДНК. Продукты синтеза первого цикла амплификации служат матрицей для второго цикла, а продукты синтеза второго цикла - матрицей для третьего цикла амплификации. Цикл амплификации проводится в термо-циклере (амплификаторе).

Достоиннства ПЦР:

1) высокая чувствительность и специфичность;

2) быстрота (применяется для экспресс-диагностики);

3) возможность идентификации труднокультивируемых микроорганизмов (внутриклеточных паразитов и персистирующих микроорганизмов);

4) возможность определения микроорганизмов непосредственно в клиническом материале без предварительного выделения чистой культуры.

Метод рекомбинации

Метод рекомбинации заключается в следующем: а) выделение ДНК из разных клеток и организмов; б) получение гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК; в) введение рекомбинантных молекул ДНК в живые клетки; г) создание условий для экспрессии секреции продуктов, кодируемых генами.

Целевые гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются из плазмид или хромосом с помощью ферментов – рестриктаз, способных резать ДНК по определенным связам или синтезируются химически. Полученный целевой ген с помощью лигаз сшивают с геном вектора (плазмиды, бактериофаги, вирусы, космиды – гибрид плазмиды с фагом). Рекомбинантная ДНК (плазмида, фаг, вирусная ДНК, космида) встраивается в микробы (E. сoli, дрожжи, вирусы и др.) или животную клетку, которая приобретает новое свойство – способность продуцировать нужные вещества (НВs-АГ вируса гепатита В, антигенов ВИЧ (р24,gp41, gp120 и др.), альфа-интерферона и др.