Малые системы нейронов

Такие системы представляют собой элементарные единицы мозговой деятельности. Изучение простых животных, например крупного брюхоногого моллюска аплизии, показывает, что Малые системы нейронов способны к некоторым формам обучения и памяти

По убеждению многих нейробиологов в конце концов будет доказано, что уникальные свойства каждого человека — способность чувствовать, думать, обучаться и помнить — заключены в строго организованных сетях синаптических взаимосвязей между нейронами головного мозга. Поскольку в человеческом мозгу исследовать эти сети трудно, важная задача нейробиологии состояла в том, чтобы создать на животных модели, пригодные для изучения того, как взаимодействующие системы нейронов формируют поведение. Нейронные сети, осуществляющие завершенные поведенческие акты, позволяют исследовать иерархию взаимосвязанных вопросов. В какой мере варьируют свойства разных нейронов? Чем определяется организация взаимосвязей между нейронами? Как разная организация взаимосвязей создает разные формы поведения? Может ли обучение модифицировать взаимосвязанные нейроны, управляющие определенным видом поведения, а если может, то посредством каких механизмов происходит запоминание?

Среди многих функций, осуществляемых благодаря взаимодействию нейронов, самые интересные те, которые связаны с обучением (способностью изменять поведение под влиянием опыта) и с памятью (способностью сохранять эти изменения в течение некоторого времени). Обучение и память — это, пожалуй, наиболее отличительные черты умственной деятельности высших животных, достигающие наивысшей формы у человека. В самом деле, человек является тем, чем он есть, в значительной мере благодаря тому, чему он обучился. Поэтому чтобы понять обучение и изучить эволюцию поведения, теоретически важно определить, на каком филогенетическом уровне нейронной и поведенческой организации можно распознать начальные проявления процессов обучения и памяти, характерных для человеческого поведения. Такое определение важно также для практики. Исследовать клеточные механизмы памяти в мозгу человека или других млекопитающих трудно потому, что у них мозг невероятно сложен. Кроме того, таким исследованиям на мозге человека препятствуют этические соображения. Поэтому для науки важно было бы эффективно исследовать эти процессы в простых системах.

Группа нейронов на микрофотографии дорсальной поверхности абдоминального ганглия морского моллюска аплизии. Справа виден особенно крупный более темный нейрон. На карте абдоминального ганглия аплизии эта клетка идентифицирована как нейрон R2.

Могут возразить, что нельзя успешно изучать память и обучение человека на простых нейронных системах. Организация человеческого мозга представляется столь сложной, что попытка изучить обучение человека в упрощенной форме на простых системах обречена на неудачу. Человек обладает интеллектом, весьма развитой речью и абстрактным мышлением, которых нет у низших животных и которые, возможно, требуют качественно иных типов нейронной организации. Хотя такие возражения существенны, решающим не является вопрос о том, есть ли нечто специфическое в человеческом мозгу. Несомненно, есть. Но вопрос скорее состоит в том, есть ли у человеческого мозга и человеческого поведения что-нибудь общее с мозгом и поведением низших животных. Там, где есть элементы сходства, они могут свидетельствовать об общих принципах организации мозга, которые доступны успешному изучению в простых нервных системах.

Ответ на вопрос о сходстве очевиден. Этологи К. Лоренц (К. Lorenz), H. Тинберген (N. Tinbergen) и К. Фриш (К. von Frisch) показали, что у людей с низшими животными много общих форм поведения, в том числе элементарное восприятие и координация движений. В особенности широко распространена способность к обучению; она развилась у многих беспозвоночных и у всех позвоночных. Сходство некоторых процессов обучения позволяет думать, что нейронные механизмы данного процесса могут обладать общими свойствами на всем протяжении филогенеза. Например, нет, по-видимому, принципиальной разницы в структуре, химизме или функции между нейронами и синапсами у человека, кальмара, улитки и пиявки. Следовательно, полный и тщательный анализ обучения у такого беспозвоночного, вероятно, способен выявить механизмы, имеющие общее значение.

Примитивные беспозвоночные привлекательны для таких исследований тем, что их нервная система содержит от 10000 до 100000 клеток в отличие от многих миллиардов у более сложных животных. Клетки собраны в отдельные группы, называемые ганглиями, и каждый ганглий обычно содержит от 500 до 1500 нейронов. Такое количественное упрощение позволило связать функцию отдельных нейронов непосредственно с поведением. В результате получен ряд важных фактов, которые приводят к новым представлениям о связи между мозгом и поведением.

Первый важный вопрос, который следует рассмотреть исследователям простых нейронных систем, состоит в том, отличны ли друг от друга разные нейроны одной области. Этот вопрос — центральный для понимания того, как поведение осуществляется нервной системой, был до последнего времени предметом обсуждения. Некоторые нейробиологи считали, что по своим свойствам нейроны мозга достаточно сходны, чтобы можно было считать их идентичными элементами, связи между которыми обладают приблизительно одинаковым весом.

Против этого теперь выдвигаются веские возражения, особенно на основании изучения беспозвоночных, показавшего, что многие нейроны доступны индивидуальной идентификации и инвариантны у каждого члена вида. Представление об индивидуальных свойствах нейронов предложено еще в 1912 г. немецким биологом Р. Гольдшмидтом (R. Goldschmidt) на основании исследования нервной системы у примитивного червя, кишечного паразита аскариды. Мозг этого червя состоит из нескольких ганглиев. Изучая эти ганглии, Гольдшмидт обнаружил, что они содержат точно 162 клетки. Число это никогда не варьировало от животного к животному, и каждая клетка всегда занимала свое характерное положение. Несмотря на такие четкие результаты, работа Гольдшмидта осталась практически незамеченной.

Более 50 лет спустя к этой проблеме вернулись независимо друг от друга две группы исследователей в Гарвардской медицинской школе. М. Оцука (М. Otsuka), Э. Кравиц (Е. Kravitz) и Д. Поттер (D. Potter), исследуя омара, и У. Фрезье (W. Frazier), И. Купферман (I. Kupfermann), Р. Вазири (R. Waziri) и Р. Коггсхолл (R. Coggeshall), исследуя крупного морского моллюска аплизию, нашли подобную же, хотя и менее полную инвариантность в более сложных нервных системах этих более развитых беспозвоночных. Сходная инвариантность вскоре была обнаружена у многих беспозвоночных, в том числе у пиявки, рака, саранчи, сверчка и ряда моллюсков. Я ограничусь здесь рассказом об исследованиях аплизии, преимущественно исследованиях отдельного ганглия, а именно абдоминального. Сходные данные получены также на других беспозвоночных.

В абдоминальном ганглии аплизии нейроны варьируют по величине, положению, форме, пигментации, по характеру импульсации и химическим веществам, посредством которых они передают информацию другим клеткам. Такие различия позволяют распознавать и называть индивидуальные клетки (Rl, L1, R15¹ и т.д.). Некоторые из этих различий проявляются в характере импульсации. Одни клетки обычно «молчат», другие спонтанно активны. Среди активных одни генерируют регулярные потенциалы действия, или нервные импульсы, другие выдают повторные краткие залпы или серии импульсов. Теперь известно, что различия в импульсации объясняются разными типами ионных токов, генерируемых мембраной тела нейронов. Мембрана тела нервной клетки совершенно отлична от мембраны ее длинного отростка, аксона. Когда мембрана аксона активна, она, как правило, создает только приток ионов натрия и отставленный по времени выход ионов калия, тогда как мембрана тела клетки может продуцировать шесть или семь разных ионных токов в различных комбинациях.

¹ R, Right — правый; L, Left — левый.— Прим. ред.

Рефлекс втягивания жабры возникает у аплизии в ответ на стимуляцию сифона или мантийного выступа. При этом жабра принимает положение, обозначенное цветной линией.

Пока еще неизвестно, обладает ли большинство клеток в нервной системе млекопитающих такой индивидуальностью. Впрочем, исследования сенсорных систем млекопитающих, описанные Д. Хьюбелом и Т. Визелем в настоящем выпуске, выявили поразительные важные различия между соседними нейронами (см. Д. Хьюбел и Т. Визель «Центральные механизмы зрения»). Работы по изучению развития головного мозга у позвоночных, описанные У. Коуэном, приводят к такому же выводу (см. У. Коуэн «Развитие мозга»),

В связи с тем фактом, что нейроны инвариантны, возникают новые вопросы. Инвариантны ли также синаптические связи между клетками? Всегда ли данная идентифицированная клетка соединена точно с тем же следующим нейроном, а не с другими? Многие физиологи изучали эти вопросы на беспозвоночных и нашли, что действительно клетки всегда образуют одни и те же виды соединений с другими клетками. Инвариантны не только связи, но и «знак», или функциональное выражение, этих связей, т.е. их тормозное или возбудительное действие.

Поэтому в, дальнейшем Фрезье, Дж. Бленкеншип (J. Blankenship), Г. Вахтель (Н. Wachtel) и я пользовались идентифицированными клетками, чтобы выявить правила, определяющие функциональные свойства связей между клетками. Отдельный нейрон обладает множеством веточек и образует множество соединений. Мы задались рядом вопросов: все ли связи нейрона специализированы для торможения или возбуждения, или же его импульсация может производить разное действие в его разных ветвях? Чем определяется возбудительный или тормозный эффект связи? В чем причина того, что связь является возбудительной или тормозной? Определяется ли знак синаптического действия химической структурой медиатора, выделяемого пресинаптическим нейроном, или же определяющим фактором служит природа постсинаптического рецептора? Выделяет ли нейрон на всех своих окончаниях один и тот же медиатор?

Карта абдоминального ганглия Aplysia californica, на которой показано положение идентифицированных нейронов; они обозначены L или R (от Left - левая и Right — правая половины ганглия) и пронумерованы. Эти нейроны являются частями скопления, образованного клетками с одинаковыми свойствами; они, кроме того, помечены буквой, обозначающей скопление (LD), и индексом, указывающим на поведенческую функцию нейрона, например, НЕ для возбудителя сердца (от Heart excitator) и G1 и G2 для двух мотонейронов жабры (от Gill — жабра).

Характер импульсации идентифицированных нейронов в абдоминальном ганглии аплизии. R2 обычно «молчит», R3 выдает регулярную импульсацию, R15 — регулярные пачки импульсов и L10 — нерегулярные пачки. L10 является командной клеткой, управляющей остальными клетками в системе.

Один из путей исследования этих вопросов состоит в том, чтобы проследить за разными связями клетки. Первая же рассмотренная нами клетка дала ясный ответ: по разным своим связям она оказывала разное действие. Она возбуждала одни следующие за ней клетки, тормозила другие и (пожалуй, совершенно неожиданно) образовывала двойственную связь, как возбудительную, так и тормозную, с третьей клеткой. Кроме того, она всегда возбуждала точно одни и те же клетки, всегда тормозила другую определенную группу клеток и всегда имела двойственную связь с третьей группой. Ее синаптическое действие создавалось одним и тем же медиатором ацетилхолином. Будет ли это действие возбудительным или тормозным, зависело от реакции медиатора с разными типами рецепторов на постсинаптических клетках. Рецепторы определяли знак синаптического действия, управляя разными ионными каналами в мембране, в основном натриевыми, для возбуждения и хлорными для торможения. Клетки, к которым приходили связи двойного действия, обладали для одного и того же медиатора рецепторами двух типов: один управлял натриевым каналом, другой — хлорным. Таким образом, функциональное свойство химической синаптической передачи определяется типом рецептора, который находится на данном постсинаптическом участке следующей клетки. [Сходные результаты получила Ж. Кихоу в Эколь Нормаль в Париже, детально проанализировав свойства разных ацетилхолиновых рецепторов.]

Инвариантность связей между клеткой L10 и некоторыми из следующих за ней клеток. А. Опыт, в котором двуствольные микроэлектроды для регистрации и для проведения тока были введены в L10, пресинаптический нейрон, и три следующие за ним клетки: L10 вызывает возбуждение (обозначено белым) в RB, торможение (черным) в LD и возбуждение и торможение в L7. Б. Соответствующие записи импульсации. В. Несколько наложенных записей, на которых виден короткий, но постоянный латентный период между импульсом в пресинаптическом нейроне и ответом двух следующих за ним клеток. Г. Наложения записей, полученных от L10 и L7, показывают, что эффект бывает возбудительным, когда L10 действует первым, как показывают высокие и узкие импульсы, и тормозным, когда он действует вторым, как показывают низкие и широкие импульсы.

Следовательно, как и предположили в свое время Л. Тауц (L. Tauc) и Г. Гершенфельд (Н. Gerschenfeld) из Института Марея в Париже, химический медиатор является лишь разрешающим агентом, а директивным компонентом синаптической передачи служат природа рецептора и ионные каналы, с которыми он взаимодействует. Этот принцип оказался в значительной мере универсальным. Он действует в нейронах позвоночных и беспозвоночных и в нейронах, использующих разные медиаторы: ацетилхолин, гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК), серотонин, дофамин и гистамин. (Ему подчиняется также действие на нейроны некоторых пептидных гормонов, о чем пойдет речь ниже.)

То, что в ганглиях беспозвоночных животных были открыты идентифицируемые клетки, которые образуют друг с другом строго определенные связи, привело к составлению «монтажных схем» разных поведенческих нейронных цепей и тем самым позволило точно исследовать причинную связь отдельных нейронов с поведением. Термин «поведение» относится к доступным наблюдению действиям организма, начиная от таких сложных актов, как речь или ходьба, и до таких простых, как движение части тела или изменение ритма сердца. К типам поведения, хотя бы отчасти исследованным у пиявок, раков и брюхоногих моллюсков, относятся питание, разные локомоторные действия и различные реакции избегания и защиты.

Первый факт, полученный в этих исследованиях, состоит в том, что отдельные клетки осуществляют над поведением специфичный и часто поразительно мощный контроль. Это можно проиллюстрировать сравнением нервного контроля работы сердца у аплизии и у человека.

Человеческое сердце бьется спонтанно. Присущий ему ритм модулируется тормозным действием холинергических нейронов (медиатором служит ацетилхолин), аксоны которых идут в составе блуждающего нерва, и возбуждающим действием норадренергических нейронов, аксоны которых образуют ускоряющий нерв. В модуляции участвует несколько тысяч нейронов. У аплизии сердце тоже бьется спонтанно; его ритм модулируется тормозным действием холинергических нейронов и возбуждающим действием серотонинергических нейронов, но в модуляции участвуют всего лишь четыре нейрона! Две клетки возбуждают сердце (по существу, важную роль играет только «главная возбудительная» клетка), и две клетки тормозят его. Три другие клетки вызывают сокращение кровеносных сосудов и тем самым регулируют кровяное давление. Поскольку отдельные клетки неизменно связаны с одними и теми же следующими за ними клетками и могут производить эффекты разного знака, некоторые из них, расположенные в критических точках нервной системы, способны управлять целой последовательностью поведенческих актов. Еще в 1938 г. К. Вирсма (С. Wiersma) из Калифорнийского технологического института в опытах на раках установил важное значение отдельных клеток для поведения и назвал их «командными клетками». Такие нейроны найдены у многих животных. Некоторые из них оказались нейронами двойного действия. Впоследствии Дж. Кестер (J. Koester), И. Мейери (Е. Mayeri) и я, работая на аплизии в Медицинской школе Ньюйоркского университета, установили, что описанный нейрон двойного действия является командной клеткой для нейронной цепи, управляющей кровообращением. Одна эта клетка учащает ритм сердца и увеличивает объем выталкиваемой им крови, возбуждая главную клетку, возбуждающую сердце, и одновременно тормозя клетки, тормозящие сердце, а также клетки, вызывающие сужение крупных кровеносных сосудов. В результате усиленной активности одного этого нейрона сердце бьется быстрее и накачивает больше крови.

Таков лишь один простой пример поведенческих функций командной клетки. У рака и даже у более сложного животного — золотой рыбки — один импульс одного командного нейрона заставляет животное спасаться от грозящей ему опасности. Недавно В. Маунткасл (V. Моuntcastle) из Медицинской школы Университета Дж. Гопкинса высказал в этой связи предположение, что в головном мозгу приматов небольшие группы клеток, возможно, выполняют подобные командные функции по управлению произвольными движениями.

Следовательно, функциональное назначение клеток двойного действия состоит в том, что они вызывают совокупность разных физиологических эффектов. Подобная же совокупность действий может быть произведена нейроэндокринными клетками — нейронами, которые выделяют гормоны (химические вещества, обычно переносимые кровотоком для действия на больших расстояниях). Абдоминальный ганглий аплизии содержит два скопления нейроэндокринных клеток, которые называются пазушными клетками. Купферман (Kupfermann), работающий в нашем отделе Медико-хирургического колледжа Колумбийского университета, Ст. Арч (St. Arch) из Колледжа Рида, а также Ф. Штрумвассер (F. Strumwasser) с сотрудниками из Калифорнийского технологического института показали, что пазушные клетки выделяют полипептидный гормон, регулирующий яйцекладку. Мейери нашел, что этот гормон оказывает длительное действие на разные клетки абдоминального ганглия, возбуждая одни и тормозя другие.

Одной из клеток, возбуждаемых этим гормоном, является командная клетка двойного действия, управляющая ритмом сердца. При этом ритм ускоряется и приток крови к тканям усиливается, что необходимо во время яйцекладки. Таким образом, на точное расположение связей, которые служат взаимодействию на близких расстояниях, накладывается столь же точно организованное взаимодействие на больших расстояниях, которое осуществляется гормонами, выделяемыми нейроэндокринными клетками. Строго определенный эффект каждого гормона, по-видимому, зависит, как и синаптические эффекты, от природы рецепторов на клетках-мишенях.

На основании того факта, что поведение управляется инвариантными клетками, связанными друг с другом точно и инвариантно, можно было бы думать, что простые животные отличаются от более сложных стереотипными и фиксированными репертуарами активности. Но это не так. Изучение разных беспозвоночных показало, что поведение простых животных вполне способно видоизменяться посредством обучения.

Регуляция поведения аплизии, осуществляемая одним нейроном (L10) и выражающаяся в его воздействии на сердечно-сосудистые мотонейроны. Известно, что L10 образует синаптические связи (А) с шестью клетками (наличие такой синаптической связи у LD_HE еще не исследовано); цвет каждой клетки показывает, какой медиатор она использует. Можно видеть (Б), что активность L10, возбуждая RB_HE и тормозя LD_HI, ускоряет сокращение сердца и повышает кровяное давление.

Мы исследовали этот вопрос весьма детально на примере одного из самых простых видов поведения аплизии — защитном рефлекторном акте, при котором стимул вызывает втягивание жабры. Жабра находится в мантийной полости. Полость покрыта мантийным выступом который заканчивается мясистым желобом — сифоном. При слабой или умеренной стимуляции сифона жабра сокращается и втягивается в мантийную полость. Этот рефлекс аналогичен реакциям избавления, присущим почти всем высшим животным, например отдергиванию руки от горячего предмета у человека. У аплизии и других животных при таких рефлексах наблюдаются две формы обучения: привыкание (габитуация) и сенситизация.

Привыкание означает ослабление поведенческой реакции при многократном повторении стимула, который вначале был новым. Когда на животное действует новый стимул, оно сначала отвечает комбинацией ориентировочного и защитного рефлексов. При повторении сигнала животное быстро обучается узнавать его. Если за ним не следует награда или он оказывается безвредным, животное ослабляет и в конце концов подавляет свои реакции на него. Хотя привыкание удивительно просто, оно, пожалуй, является самой распространенной формой обучения. Путем привыкания животные, включая человека, научаются игнорировать стимулы, утратившие новизну или значение. Привыкание освобождает их для реакций на стимулы, которые влекут за собой награду или имеют значение для выживания. Считается, что привыкание является первым процессом обучения, возникающим у детей; оно обычно используется для изучения развития таких интеллектуальных процессов, как внимание, восприятие и память.

Нейронная цепь поведенческого рефлекса втягивания жабры у аплизии показана в виде схемы. Животное рефлекторно втягивает жабру, когда на сифон действует какой-нибудь стимул. Кожу сифона иннервируют 24 сенсорных нейрона; на схеме показаны только восемь из них. Сенсорные нейроны образуют моносинаптические, или прямые, связи с шестью идентифицированными мотонейронами жабры, показанными в ряду, который начинается с L7, и по меньшей мере с одной тормозной клеткой (L16) и с двумя возбуждающими вставочными нейронами (L22 и L23), которые образуют синапсы с мотонейронами.

В привыкании у позвоночных интересно то, что оно порождает и кратковременную и долговременную память и поэтому используется для исследования связи между ними. Мы с Т. Кэрью (Т. Carew) и Г. Пинскером (Н. Pinsker) нашли подобную связь у аплизии. После одного тренировочного опыта, состоящего из 10-15 тактильных раздражений сифона, наступает привыкание рефлекса втягивания. Память на этот стимул кратковременная; через час можно обнаружить частичное восстановление, а через день оно обычно становится почти полным. При таком типе обучения восстановление равнозначно забыванию. Однако при повторении более сложных задач обучения четыре повторных тренировочных опыта, всего лишь по 10 стимулов каждый, вызывают глубокое привыкание и запоминание стимула, которое длится недели.

Первый вопрос, каким задались мы с В. Кастеллучи (V. Castellucci), Купферманом и Пинскером, состоял в следующем: где локализуется кратковременное привыкание и каковы его механизмы? Нейронная цепь, управляющая втягиванием жабры, совсем проста. Стимуляция кожи сифона активирует там 24 сенсорных нейрона; они образуют прямые связи с четырьмя мотонейронами в жабре, а мотонейроны прямо соединены с мышцей. Сенсорные нейроны возбуждают также несколько вставочных, т.е. промежуточных нейронов.

Исследуя эти клетки во время привыкания, мы нашли, что при кратковременном привыкании изменяется сила связи сенсорных нейронов со следующими за ними центральными клетками — вставочными и мотонейронами. Такая локализация была весьма удачной, потому что позволяла исследовать, что происходит при привыкании, путем анализа изменений в обеих клетках — пресинаптическом сенсорном нейроне и постсинаптическом мотонейроне — и в единственной группе связей между ними.

Силу связи можно определять, регистрируя синаптическое действие, вызываемое в мотонейронах отдельным сенсорным нейроном. Можно имитировать опыт по тренировке привыкания, состоящей из 10—15 стимулов, непосредственно стимулируя сенсорный нейрон в той же строгой временной последовательности, какая применяется для целого животного. Стимул можно отрегулировать таким образом, чтобы он вызывал один потенциал действия. Когда нейрон отвечает потенциалом действия впервые, он производит весьма эффективное синаптическое действие, которое выражается крупным возбудительным постсинаптическим потенциалом в мотонейроне. Последующие потенциалы действия, создаваемые в сенсорном нейроне во время тренировочного опыта, вызывают все меньшие возбудительные постсинаптические потенциалы. Эта депрессия эффективности связи идет параллельно поведенческому привыканию и определяет его. Как и поведение, синаптическая депрессия, создаваемая одним тренировочным опытом, сохраняется больше часа. После второго такого опыта депрессия синаптического потенциала выражена сильнее, а последующие тренировочные опыты могут подавить синаптический потенциал полностью.

В чем причина изменений силы синаптических связей? Происходит ли изменение в пресинаптическом сенсорном нейроне, которое выражается в пониженном выходе медиатора, или же изменяется постсинаптическая клетка, что выражается в снижении чувствительности рецепторов к медиатору? Ответить на эти вопросы можно, проанализировав изменения амплитуды синаптического потенциала, проявляющиеся в его «квантовых» компонентах.

Процесс привыкания, когда реакция животного на стимул постепенно ослабевает, если он оказывается несущественным, является элементарной формой обучения и памяти, которая обнаруживается на уровне одиночного мотонейрона (М. Н.). Здесь показан такой опыт (А), в котором сенсорный нейрон (С. Н) аплизии образующий синапс на мотонейроне L7, стимулируется каждые 10 секунд Б. Отдельные кадры из двух последовательных тренировочных серий по 15 стимулов каждая, разделенных интервалами по 15 минут, показывают как ответ L7 они жается и исчезает.

Как впервые показали X. дель Кастильо (J. del Castillo) и Б. Катц (В. Katz) в Лондонском университетском колледже, медиатор выделяется не в виде отдельных молекул, а «квантами», или мультимолекулярными пакетами. Все пакеты содержат приблизительно одинаковое количество медиатора (по нескольку тысяч молекул). Как полагают кванты хранятся в субклеточных органеллах, называемых синаптическими пузырьками, которые во множестве видны в синаптических окончаниях на электронных микрофотографиях. Поскольку число молекул медиатора в каждом кванте обычно не меняется, количество квантов высвобождаемых каждым потенциалом действия, служит достаточно надежным показателем общего количества выделившегося медиатора Каждый квант в свою очередь вызывает в постсинаптической клетке миниатюрный постсинаптический потенциал характерной величины Величина эта служит показателем того, насколько чувствительны постсинаптические рецепторы к нескольким тысячам молекул медиатора выделяемым каждым пакетом.

Долговременное привыкание выявляется при сравнении синаптических связей между сенсорным нейроном (С. Н.) и мотонейроном L7 у нетренированной аплизии (контроль, А) и у аплизии, тренированной на долговременное привыкание (Б). У контрольных животных за импульсом в сенсорном нейроне следует крупный возбудительный синаптический ответ мотонейрона. У тренированных животных синаптическую связь почти невозможно обнаружить.

Исследуя аплизию, мы с Кастеллучи, нашли, что снижение амплитуды синаптического потенциала действия по мере привыкания идет параллелъно уменьшению числа выделяющихся химических квантов. Напротив, величина миниатюрного постсинаптического потенциала не менялась, что указывало на неизменность чувствительности постсинаптического рецептора. Эти данные говорят о том, что кратковременное привыкание локализуется в пресинаптических окончаниях сенсорных нейронов и что механизм привыкания состоит в постепенном снижении количества медиатора, высвобождаемого окончаниями сенсорного нейрона на центральных клетках-мишенях. Опыты на раке, проведенные Р. Цукером (R. Zucker) из Калифорнийского университета в Беркли и Ф. Красне (F. Krasne) из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, а также опыты на кошке, поставленные П. Фейрелом (P. Farel) и Р. Томпсоном (R. Thompson) из Калифорнийского университета в Эр-вине, показывают, что этот механизм может быть универсальным. От чего зависит уменьшение числа квантов, высвобождаемых каждым потенциалом действия? Это число в значительной степени определяется концентрацией свободного кальция в пресинаптическом окончании. Кальций является одним из трех ионов, участвующих в генерации каждого потенциала действия в окончании. Деполяризующий эффект потенциала действия создается главным образом притоком ионов натрия в окончание, но он требует также меньшего и более позднего притока ионов кальция. Реполяризационное действие противоположного знака производится преимущественно выходом ионов калия, а приток кальция нужен для выделения медиатора. Как полагают, кальций придает синаптическим пузырькам способность связываться с пресинаптической мембраной в местах выделения медиатора. Это связывание является критическим этапом, предваряющим выход медиатора из пузырьков (процесс называется экзоцитозом). Возможно поэтому, что количество кальция, приходящее в окончания с каждым потенциалом действия, не фиксировано, а меняется и модулируется привыканием.

Наилучшим способом изучать изменения притока кальция в окончания была бы прямая регистрация активности в окончаниях. Нам не удалось осуществить ее из-за очень малых размеров окончаний. Но поскольку свойства кальциевых каналов в окончаниях сходны с их свойствами в теле клетки, один из наших дипломников М. Клейн (М. Klein) занялся исследованием изменений кальциевого тока в теле клетки, которые сопровождают синаптическую депрессию.

Кальциевый ток возникает и медленно нарастает во время потенциала действия; его обычно перекрывает калиевый ток. Для того чтобы демаскировать первый из них, мы действовали на ганглий тетраэтиламмонием (ТЭА) - веществом, которое в некоторой степени избирательно блокирует поздний калиевый ток. Блокируя реполяризующее действие калиевого тока, ТЭА незначительно удлиняет потенциал действия. Удлинение это в большой мере обусловлено беспрепятственным действием кальциевого тока. Вызываемое ТЭА удлинение потенциала действия служит хорошим критерием изменения кальциевого тока.

Затем мы определяли выделение медиатора из окончаний сенсорных нейронов по величине синаптического потенциала в мотонейроне и измеряли одновременно регистрируемые изменения кальциевого тока по критерию длительности потенциала действия. Мы нашли, что многократная стимуляция сенсорного нейрона с частотой, вызывающей привыкание, приводила к постепенному укорочению кальциевого компонента потенциала действия, что происходило параллельно уменьшению выхода медиатора. Спонтанное восстановление синаптического потенциала и поведения сопровождалось усилением кальциевого тока.

То, что мы до сих пор узнали о механизмах кратковременного привыкания, показывает, что этот тип обучения связан с модуляцией силы ранее сформированной синаптической связи. Сила связи определяется количеством выделяемого медиатора, которое в свою очередь зависит от того, насколько потенциал действия в пресинаптическом окончании активирует кальциевый ток. Поэтому сохранение кратковременного привыкания основано на том, что депрессия кальциевого тока в пресинаптическом окончании не прекращается в течение минут и часов.

Каковы пределы этого изменения? Насколько может измениться эффективность данного синапса в результате обучения, и как долго сохраняются такие изменения? Выше я указывал, что многократные тренировочные опыты могут привести к полной депрессии синаптических связей между сенсорными и моторными клетками. Удерживается ли такое состояние? Может ли долговременное привыкание привести к полной и длительной инактивации ранее активного синапса?

В связи с этими вопросами исследователи обучения давно ведут споры о соотношении кратковременной и долговременной памяти. Наиболее принято представление, что эти два вида памяти связаны с разными процессами. Однако оно основано на косвенных данных.

Совместно с Кастеллучи и Кэрью мы предприняли более прямую проверку этой гипотезы путем сравнения эффективности связей, образоманных популяцией сенсорных нейронов с идентифицированным мотонейроном жабры L7, в четырех группах аплизий: у нетренированных животных, служивших контролем, и в группах, исследованных соответственно через сутки, неделю и три недели после выработки долговременного привыкания. Было обнаружено, что у контрольных животных около 90% сенсорных нейронов имели чрезвычайно эффективные связи с L7, тогда как у животных, исследованных через сутки и через неделю после долговременного привыкания, их число составляло 30%. Даже через три недели только у 60% клеток можно было обнаружить связи с L7. Таким образом, в результате простого обучения ранее эффективные синаптические связи становятся неактивными и остаются в таком состоянии более недели.

Следовательно, в то время как кратковременное привыкание сопровождается кратким ослаблением эффективности синапса, долговременное привыкание вызывает более продолжительное и глубокое изменение, которое приводит к функциональному нарушению большинства ранее эффективных связей. Эти данные интересны по трем причинам: 1) они служат прямым доказательством того, что специальный случай долговременной памяти может быть объяснен продолжительным изменением эффективности синапса; 2) они показывают, что достаточно поразительно малой тренировки, чтобы вызвать глубокое изменение синаптической передачи в синапсах, играющих решающую роль при обучении, и 3) они ясно показывают, что кратковременное и долговременное привыкания локализуются в одной и той же части нейрона, а именно в синапсах, образованных сенсорными нейронами на мотонейронах. Кратковременное и долговременное привыкания связаны также с одним и тем же клеточным механизмом — депрессией передачи возбуждения. Теперь нужно определить, является ли долговременная синаптическая депрессия пресинаптической и связана ли она с инактивацией натриевого тока. Если окажется, что это так, то тем самым на более основательном уровне подтвердится представление о едином механизме кратковременной и долговременной памяти.

Сенситизация представляет собой несколько более сложную форму обучения; ее можно обнаружить на рефлексе втягивания жабры. Сенситизация представляет собой длительное усиление ранее существовавшего ответа животного на стимул в результате нанесения другого, ноцицептивного (болевого, повреждающего) стимула. В то время как привыкание требует от животного, чтобы оно научилось итерировать определенный стимул, потому что его последствия несущественны, сенситизация требует, чтобы животное научилось обращать внимание на стимул, так как он сопровождается потенциально болезненным эффектом или опасными последствиями. Поэтому когда на голову аплизии наносится вредоносный стимул, рефлекс втягивания жабры па многократную стимуляцию сифона очень усиливается. Как и привыкание, сенситизация может длиться от минут до дней и недель в зависимости от длительности тренировки. Здесь будет рассмотрена только ее кратковременная форма.

Мы с Кастеллучи установили, что сенситизация влечет за собой изменение синаптической передачи в том же самом пункте, который участвует в привыкании, а именно в синапсах, образованных сенсорными нейронами на центральных клетках-мишенях. Наши физиологические исследования и последующие морфологические исследования К. Бейли (С. Baily), М. Чен (М. Chen) и Р. Хоукинса (R. Hawkins) показывают, что нейроны, осуществляющие сенситизацию, оканчиваются близ синаптических терминалей сенсорных нейронов и усиливают выход медиатора, увеличивая число квантов, высвобождаемых каждым потенциалом действия в сенсорном нейроне. Поэтому такой процесс называется пресинаптическим облегчением. Эти данные представляют интерес, так как они показывают [как и более ранние данные о пресинаптическом торможении в другой системе, полученные Дж. Дьюделом (J. Dudel) и С. Куфлером (S. Kuffler) из Гарвардской медицинской школы], что нейроны обладают рецепторами для медиаторов в двух совершенно разных участках. От рецепторов на теле клетки и на дендритах зависит, возникнет ли в клетке потенциал действия, а от рецепторов на синаптических окончаниях зависит, сколько медиатора высвободится при каждом потенциале действия.

Поэтому на одни и те же пункты — пресинаптические окончания сенсорных нейронов — могут воздействовать противоположным образом две противоположные формы обучения. Во время привыкания они угнетаются в результате возникающей собственной активности нейрона, а при сенситизации в них наступает облегчение вследствие активности других нейронов, которые образуют на них синапсы. Эти данные, полученные на уровне отдельной клетки, подтверждают наблюдение, сделанное на поведенческом уровне, что привыкание и сенситизация представляют собой независимые друг от друга противоположные формы обучения.

В связи с этими данными возникает интересный вопрос. Сенситизация способна усилить нормальный рефлекс, но может ли она противодействовать глубокой депрессии рефлекса, вызванной долговременным привыканием? Если может, то восстанавливает ли она синаптические связи, полностью инактивированные долговременным привыканием?

Сенситизация является такой формой обучения и памяти, при которой ответ на стимул усиливается под влиянием другого, более сильного стимула. Здесь рефлекс втягивания жабры у аплизии усиливается в результате ноцицептивного раздражения области головы. Этот стимул активирует нейроны, которые возбуждают облегчающие вставочные нейроны (В. Н.); последние оканчиваются на синаптических окончаниях сенсорных нейронов. Эти нейроны пластичны, т. е. способны изменять эффективность своего синапса. Медиатор облегчающих вставочных нейронов, предположительно серотонин (точки в кружке), модулирует выделение медиатора сенсорного нейрона на возбуждающие вставочные нейроны и мотонейроны.

Кэрью, Кастеллучи и я изучили этот вопрос и нашли, что сенситизация устраняла депрессию в поведении. Кроме того, за один час сенситизирующая стимуляция головы аплизии восстанавливала функционально инактивированные синапсы (которые оставались бы в таком состоянии в течение недель).

Следовательно, в головном мозгу имеются синаптические пути, которые детерминированы процессами развития, но которые, будучи предрасположены к обучению, могут быть функционально инактивированы или реактивированы опытом. В самом деле, для этих поддающихся модификации синапсов достаточно небольшой тренировки или приобретенного опыта, чтобы вызвать в них глубокие изменения. Если бы эти данные оказались применимыми к мозгу человека, то это означало бы, что даже при простом социальном акте, например при беседе двух людей, активность нейронной механики в мозгу одного человека способна оказывать прямой и, возможно, длительный эффект на модифицируемые синаптические связи в мозгу другого.

Для экспериментатора особенно привлекательна кратковременная сенситизация, так как она обещает быть доступной биохимическому анализу. В качестве первого шага мы с Хоукинсом и Кастеллучи идентифицировали специальные клетки в абдоминальном ганглии аплизии, которые создают пресинаптическое облегчение. Вводя животному электроноплотную метку, чтобы наполнить ею нейрон и пометить его синаптические окончания, мы нашли, что последние содержат пузырьки, сходные с обнаруженными у аплизии Л. Школьник (L. Shkolnik) и Дж. Шварцем (J. Schwartz) в нейроне, медиатором которого, как ранее было установлено, является серотонин. В соответствии с возможной серотонинергической природой этой клетки, М. Брунелли (М. Brunelli), Кастеллучи, Т. Томоски-Сайкс (Т. Tomosky-Sykes) и я нашли, что серотонин усиливал моносинаптическую связь между сенсорным нейроном и мотонейроном L7, тогда как другие вероятные медиаторы подобного действия не оказывали.

Далее мы обнаружили интересную связь между серотонином и внутриклеточным посредником — циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ). Со времени классической работы И. Сьюзерленда-мл. (Е. Sutherland, Jr.) и его сотрудников в Университете Вандербилта известно, что большинство пептидных гормонов не входят в клетку-мишень, а действуют на рецептор клеточной поверхности и стимулируют фермент, называемый аденилатциклазой; этот фермент катализирует в клетке превращение аденозинтрифосфата (АТФ) в цАМФ, который затем действует как «второй посредник» («первым посредником» является гормон) в нескольких точках внутри клетки и вызывает ряд соответствующих изменений функции.

X. Седар (Н. Cedar), Шварц и я нашли, что сильная и длительная стимуляция проводящего пути, который идет у аплизии от головы и по которому осуществляется сенситизация, через синапс повышала содержание цАМФ во всем ганглии. Седар и Шварц, а также И. Левитан (I. Levitan) и С. Барондес (S. Barondes) показали, что длительное повышение содержания цАМФ можно вызвать также инкубацией ганглия с серотонином. Для выяснения связи между серотонином и цАМФ Брунелли, Кастеллучи и я вводили цАМФ в тело сенсорного нейрона и установили, что он тоже вызывает пресинаптическое облегчение, тогда как инъекция 5'-АМФ (продукта распада цАМФ) или другого второго посредника — циклического ГМФ — не давала такого эффекта.

Поскольку привыкание связано с уменьшением кальциевого тока, заманчиво было думать, что цАМФ производит свое облегчающее действие, усиливая кальциевый ток. Как было сказано, кальциевый ток обычно маскируется калиевым током. Поэтому мы с Клейном проследили за потенциалами действия в сенсорных нейронах, в которых калиевый ток был ослаблен посредством ТЭА. Стимуляция пути, который идет от головы и по которому осуществляется сенситизация, или же стимуляция одиночного облегчающего нейрона, усиливала кальциевый ток, что было видно по удлинению потенциала действия на фоне ТЭА, и это усиление сохранялось 15 минут или дольше. Оно шло параллельно с увеличением выхода медиатора, и параллельно этим двум синаптическим изменениям возрастал рефлекс на сенситизирующий стимул.

Усиление кальциевого тока, выраженное в продлении кальциевого компонента потенциала действия после стимуляции сенситизирующего пути, можно было создать внеклеточным нанесением серотонина или двух веществ, которые повышают внутриклеточный уровень цАМФ, ингибируя фосфодиэстеразу — фермент, катализирующий расщепление цАМФ. Такие же эффекты наблюдались после прямой внутриклеточной инъекции цАМФ, но не 5'-АМФ.

На основании этих данных Клейн и я предположили, что стимуляция облегчающих нейронов сенситизирующего пути ведет к выходу серотонина, который активирует серотонин-чувствительный фермент (аденилатциклазу) в мембране окончания сенсорного нейрона. Возникающее при этом в окончании увеличение количества цАМФ ведет к усиленной активации кальциевого тока либо непосредственно путем активации кальциевого канала, либо косвенно, снижением противодействующего калиевого тока. С каждым потенциалом действия растет приток кальция и выход медиатора.

Главное, что вначале привлекло к использованию аплизии для изучения поведения, было наличие крупных клеток, электрические свойства и связи которых доступны детальному исследованию. А теперь размеры этих клеток могут оказаться еще более выгодными для изучения субклеточных и биохимических механизмов обучения, с одной стороны, и возможных изменений мембранной структуры — с другой. Так, например, интересно узнать поточнее, как повышение уровня цАМФ при сенситизации связано с активацией кальциевого тока, поскольку установление механизма этой связи может послужить первым шагом к пониманию на молекулярном уровне этой простой формы кратковременного обучения.

На память приходит целый ряд механизмов. Как полагают, каналы, по которым ионы проходят через мембрану нейрона, состоят из белковых молекул. Поэтому очевидная возможность состоит в том, что цАМФ активирует одну или более протеинкиназ — ферментов, которые, по предположению П. Грингарда (P. Greengard) из Медицинской школы Йельского университета, могли бы служить общим молекулярным механизмом различных эффектов цАМФ внутри клетки. Протеинкиназы — это ферменты, которые фосфорилируют белки, иначе говоря, присоединяют фосфорильную группу к боковой цепи аминокислот серина или треонина в белковой молекуле и этим придают белкам иной заряд и иную конфигурацию, что меняет их функцию, активируя одни и инактивируя другие. Фосфорилирование могло бы служить эффективным механизмом регуляции памяти. Один из способов, каким могла бы действовать сенситизация, состоит в том, что белок кальциевого канала активируется (или же белок антагонистического калиевого канала инактивируется) при фосфорилировании его протеинкиназой, зависимой от цАМФ.

Модель кратковременной сенситизации и привыкания на уровне одиночного сенсорного нейрона, начиная с контрольной ситуации, когда клетка генерирует импульсы до наступления сенситизации или привыкания. Нервный импульс в концевой мембране нейрона открывает параллельно натриевым каналам (Na ⁺ ) ряд каналов для ионов кальция (Са⁺⁺). Сенситизация вызывается группой клеток L29 (возможно, и другими), которые, как полагают, выделяют медиатор серотонин. Он действует на аденилатциклазу, фермент, катализирующий синтез циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в нейронных окончаниях. цАМФ повышает приток ионов кальция, возможно, создавая больше кальциевых каналов. Кальций усиливает слияние содержащих медиатор пузырьков с мембраной в местах его выделения, увеличивая вероятность последнего. При привыкании многократная импульсация в окончаниях, возможно, уменьшает число открытых кальциевых каналов, понижая приток кальция и инактивируя синапс.

Сенситизация занимает интересное место в иерархии обучения. Ее часто считают предшественницей классического условного рефлекса. В обеих этих формах рефлекс на стимул усиливается в результате активации другого пути. Сенситизация отличается от условного рефлекса тем, что она не ассоциативна; сенситизирующий стимул повышает рефлекторную реактивность независимо от того, сочетается ли он во времени со стимулом, вызывающим рефлекс. Теперь Э. Гелперин (A. Gelperin) из Принстонского университета, Дж. Мпитсос (G. Mpitsos) и С. Коллин (S. Collins) из Университета Кейса Западной резервной территории, а также Т. Кроу (Т. Crow) и Д. Олкон (D. Alkon) из Национальных институтов здравоохранения к настоящему времени обнаружили у моллюсков несколько типов ассоциативного обучения. Недавно мы с Т. Уолтерсом (Т. Walters) и Кэрью получили доказательства ассоциативного обучения у аплизии. Поэтому скоро мы будем в состоянии точно проанализировать, как механизмы сенситизации соотносятся с механизмами ассоциативного обучения.

Другое возможное теперь направление исследования состоит в рассмотрении связи между исходным развитием нейронной цепи у эмбриона и ее последующей модификацией обучением. И при развитии, и при обучении в нервной системе происходят функциональные изменения — меняются эффективность синапсов и другие свойства нейронов. Как соотносятся такие изменения? Основаны ли механизмы обучения на механизмах пластичности, проявляющейся во время развития или же позднее формируются совершенно новые специализированные для обучения процессы?

Какими бы ни оказались ответы на эти интригующие вопросы, при исследовании беспозвоночных животных возникло поразительное и обнадеживающее обстоятельство: теперь стало возможным точно локализовать и наблюдать на клеточном - а в конце концов, возможно, и на молекулярном - уровне простые свойства памяти и обучения. Хотя для сложного головного мозга высших животных характерны некоторые высшие проявления умственной деятельности, теперь стало ясно, что элементарные свойства того, что считается мыслительными процессами, можно обнаружить в активности лишь очень малого числа нейронов. Поэтому и с философской, и с методической точек зрения интересно будет узнать, в какой степени высшие формы мышления можно объяснить действием более простых компонентов и механизмов. В той мере, в какой возможны такие редукционистские объяснения, важно также установить, как единицы этой элементарной азбуки комбинируются для создания языка гораздо более сложных мыслительных процессов.