Включение ферментов в волокна

Фермент, включенный в волокно, может существоватъ в растворе, находясь непосредственно в окружении самого волокна (обычные волокна) или в ограниченной его части - полой области (полые волокна). Для получения волокон первого типа различные полимеры (целлюлоза, триацетат целлюлозы, нитроцеллюлоза, этилцеллюлоза, поливинилхлорид) растворяют в органическом растворителе, эмульгируют с раствором или суспензией фермента, затем продавливают между мелкое сито в коагулирующую жидкость. Образуюшиеся волокна представляют собой полимерные гели, которые содержат в своей структуре водный раствор фермента. Уровень активности фермента. включенного в волокна, ниже чем в нативном состоянии. С другой стороны, стабильность фермента. заключенного в волокно выше, чем фермента в растворе.

Волокна второго типа, так называемые полые волокна, изготовляются из природных или синтетических полимеров, и имеют внутреннюю полую область. Полая область заполняется ферментом, который удерживается за счёт физической иммобилизации или химической связи между активными группами фермента и группами, находящимися на внутренней поверхности волокна. Полые волокна большого размера называют трубками.

Каталитические свойства ферментов, включенных в волокна, используются в медицине в экстракорпоральных шунтах для детоксикации организма при различных патологических состояниях: в ферментных реакторах, для диагностических целей.

Включение в липосомы.Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.

Липосомы - искусственно полученные, замкнутые, сферические частипы, образованиые бимолекулярными липидными слоями, чаще всего фосфолипидами, в пространстве, между которыми содержится среда формирования. Благодаря особенностям структуры липосомы могут использоваться для доставки как гидрофильных (заключённые в водное пространство бислои), так и гидрофобных (заключённые в липидные бислои) лекарственных веществ.

Разработкой липосомальных форм Лекарственных препаратов занимаются в настоящее время более 10 западных фирм. Ведущими в этой области являются три американские фирмы:

"Le Liposome compani",

"Liposome Thechnology tne" ct

"Vestor"

Фосфолипиды, имеющие гидрофильные и гидрофобные группировки, образуют в водных растворах при высокой концентраиии замкнутые сферические бислойные структуры, внутрь которых могут быть заключены лекарственные вещества, что и легло в основу технологии липосом. Структура липосом напоминает клеточную мембрану. Поэтому липосомы являются физиологическим материалом, который организм легко может утилизировать, они легко проникают через различные физиологические барьеры и усиливают процесс адсорбции препарата в организме, заключённые внутрь липосом препараты не диффундируют , поэтому при введении таких препаратов не наблюдаются иммунные и другие системные реакции организма. Распадаются липосомы естественным путём, высвобождая заключённое в них лекарственное ве-щество. Они, таким образом, обеспечивают контролируемое высвобожде-ние лекарственного вещества и позволяют применять более высокие дози-ровки препаратов. Кроме того, липосомы имеют тенденцию накапливаться в определённых тканях (например, в печени, селезёнке, лёгких и пр.), что позволяетосуществлять целенаправленный транспорт лекарственных веществ к органам-мишеням,

В зависимости от способа получения размер липосом может быть от 1000 А° до 2 - 10 мкм. Для доставки лекарственных веществ обычно применяются липосомы размером от 25 нм до нескольких микрометров. Способ получения определяет и структуру везикул - они могут быть однослойными (моноламиллярными) или многослойными (мультиламиллярными).

Липосомы можно вводить как перорально, так и парентерально. При этом в большинстве случаев отмечено повышение терапевтического эффекта и пролонгированное действие лекарственных веществ, что обусловлено их задержкой в системе циркуляции и замедленным разрушением ферментами плазмы.

При этом фосфолипиды липосомальной мембраны используются организмом как компоненты клеточных мембран или вовлекаются в метаболизм. Наличие мембраны. сходной по составу и структуре с цитоплазматической облегчает проникновение в клетки посредством диффузии. слияния или пиноцитоза.

Заключение лекарственных вешеств в липосомы позволяет также снизить побочные действия токсичных препаратов.

Известно, что липосомы усиливают проникающую способность активных ингредиентов в кожу и, поэтому, перспективно их использование в дерматологии.

Включают в липосомы обычные, хорошо известные препараты, в частности противоопухолевые антибиотики, противогрибковые, а также вакцины и ферменты.

В качестве активных компонентов, включённых в липосомы, из-вестны и витамины А, Е, С, а также растительные экстракты - женьшеня, алоэ и др.

Получен липосомальный инсулин и установлен выраженный ги-погликемический эффект на белых беспородных крысах с индуцированным сахарным диабетом. Снижение уровня глюкозы в крови начиналось через 1 час после введения препарата, через 4 часа достигало максимального значения, действие продолжалось в течение 24 часов.

Учитывая сведения об избирательности захвата органами ретикулоэндотелиальной системы липосом, а также лимфоидномакрофильный характер туберкулёзных гранул, предложено использовать для химиотерапии туберкулёза липосомальные формы противотуберкулёзных препаратов - изониазида, стрептомицина.

Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран, поэтому изучение липосом имеет большое значение для понимания закономерностей процессов жизнедеятельности в клетке.

13. Микрокапсулирование биообъектов как один из методов их иммобилизации. Микрокапсулы. Характеристика. Вспомогательные вещества. Виды оболочек.

Этот способ иммобилизации ферментов разработан Т. Чангом (1964). Суть его состоит в том, что водный раствор фермента включают внутрь микрокапсул. представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (мембраной). В зависимости от условий получения размер микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров, а толщина мембраны составляет сотые — десятые доли микрометра, при диаметре пор порядка несколькнх нанометров. Существует два огновных способа получения микро-капсул. В первом из них водный раствор фермента сначала диспсргируется нри энергичном перемешивании в диэтиловом эфире, содержащем ПЛВ, которое выступает в роли эмульгатора. К полученной эмульсии, не прекращая перемешивания, добавляют эфирный раствор полимера, обычно нитрата целлю-лозы. При соприкосновснии с поверхностью эмульсионных капель этот полнмер, будучи нерастворимым в воде, образует тонкую оболочку-микрокапсулу. Готовые микрокапсулы отдсляют центрифугированием или фильтрованнем и промывают.

При втором способе микрокапсулирования образованне мембраны на поверхности водных микрокапель достигается за счет реакции межфазной поликонденсации двух компонентов, один из которых растворен в водных каплях эмульсии, а другой - в объеме органнческой фазы. Наиболее распространенными яв-ляются полиамндные микрокаисулы, получаемые, например, путем пбликонденсации 1,6-гексаметиленднамина (воднан фаза) и хлорангидрнда себаиновой кислоты (органическан фаза). Этот сиособ применим только для тех фсрмснтов, которые не инактивируютси при высоких значеннях рН, существующих в водных растворах диамина.

Водный раствор фермента, использующийся для получения микрокапсул, должен содержать инертный белок (обычно гемоглобин) в концентрации около 10%, который обсспсчивает в микрокапсулах нсобходимое внутрсннсе давление н стабилнзирует фермент. Для повышения стабильности микрокапсулированного фермента его нередко иодвергают также обработке глутаровым альдегндом, приводящсй к образованию внутри микрокапсул белковых полимеров. Кроме того, более высокой стабилыюсти можно добиться, если перед микрокапсулированием фермент предварительно иммобилизовать путем адсорбции на носителе, включения в гель или другим способом.

В некоторых случаях для иммобилизации применяются микрокапсулы, мембрана которых образоваиа ковалентно сшитыми между собой молекулами инертного белка. Такие микро-капсулы можно получить, если в методе с применением поликонденсации в систсму не вводить диамин. Тогда хлорангидрид дикарбоновой кнслоты (или другой используемый органорастворимый бнфункциональный сшивающий агент) будет образовывать ковалентные сшивки между молекулами инертиого белка, располагающимися на поверхности водной микрокапли.

14. Методы получения микрокапсул. Классификация. Характеристика. Технологические схемы производства.

Методы микрокапсулирования подразделяются на 3 группы:

• физические;

• физико-химические;

• химические.

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Суть физических методов заключается в механическом нанесении оболочки на твердые или жидкие частицы лекарственного вещества путем: дражирования; распыления; напыления в псевдоожиженном слое; напыления в вакууме; диспергирования в системе жидкость-жидкость; электростатического микрокапсулирования; микрокапсулирования с помощью центрифуги (экструзионный метод).

Физические методы выгодно отличаются от других методов микрокапсулирования тем, что в них капсулируемое вещество и раствор (или расплав) материала оболочки не контактируют до самого момента капсулирования.

Наиболее простым физическим методом микрокапсулирования является метод дражирования. При этом методе однородные фракции кристаллов загружают во вращающийся дражировочный котел, и они из форсунки покрываются раствором пленкообразователя. Образующиеся микрокапсулы высыхают в токе нагретого воздуха. Толщина оболочки в данном случае зависит от концентрации полимера, скорости распыления раствора полимера и температуры.

Получение микрокапсул с твердым ядром и жировой оболочкой проводится методом распыления. При этом методе твердое вещество суспендируют в растворе или расплаве жирового компонента (воск, цетиловый спирт, стеариновая кислота и др.) с последующим распылением раствора или суспензии в распылительной сушилке. В результате этого частицы капсулируемого вещества покрываются жидкими оболочками, которые затем затвердевают в результате исцарения растворителя или охлаждения расплава.

Процесс распыления при охлаждении считают удобным, но дорогим, его используют при получении микрокапсул витаминов, ферментов, антибиотиков. Метод сушки при распылении является одним из первых методов микрокапсулирования.

Метод диспергирования в несмешивающихся жидкостях можно использовать для жидких и твердых лекарственных веществ. Технология микрокапсул заключается в следующем:

• получают раствор пленкообразователя (водный, спиртовый или используют другой органический растворитель);

• в растворе пленкообразователя диспергируют лекарственное вещество, получая эмульсию или суспензию, или растворяют, получая гомогенную систему;

• раствор пленкообразователя с лекарственным веществом в виде тонкой струйки или капель подается в сосуд с работающей мешалкой и несмешивающейся жидкостью, часто с парафиновым маслом.

Попадающий в масло водный раствор пленкообразователя с распределенным в нем лекарственным веществом диспергируется на мелкие капельки, которые охлаждаются и затвердевают. Полученные микрокапсулы отделяют от масла, промывают и сушат.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОКАПСУЛ

Физико-химические методы микрокапсулирования основаны на разделении фаз и отличаются относительной простотой аппаратурного оформления, высокой производительностью, способностью заключать в оболочку лекарственное вещество в любом агрегатном состоянии.

Физико-химические методы можно подразделить на следующие: выделение новой фазы (простая и сложная коацерва-ция); испарение легколетучего растворителя в жидкой среде; затвердевание при охлаждении в жидкой среде и др.

Метод выделения новой фазы из раствора пленкообразующего вещества можно осуществлять как в водной среде, так и в среде органического растворителя. В основе водно-фазового разделения лежит явление коацервации — расслоение двух жидких фаз в растворах полимеров.

В определенных условиях однородные прозрачные растворы липидов, белков, нуклеиновых кислот, углеводов и других соединений могут расслаиваться на две жидкие фазы: фазу обедненную и фазу обогащенную этими веществами. Отделение более концентрированной фазы может происходить в виде слоя и в форме капель. Процесс фазового расслоения получил название коацервации, а вся система — коацерват (от лат. coacervare — сгребать в кучу). Коацервация начинается при изменении хотя бы одного из параметров дисперсной системы: температуры, состава рН, введение химических добавок и др.

Различают простую и сложную коацервацию. Простая коа-цервация имеет место при взаимодействии одного полимера и лекарственного вещества. Сложная коацервация — при взаимодействии двух полимеров, имеющих отрицательный и положительный заряд.

Процесс образования микрокапсул простой коацервацией может быть представлен следующей схемой, приведенной на рис. 63. Процесс протекает следующим образом. Капсулируе-мое вещество эмульгируют в растворе желатина. В качестве капсулируемого продукта берут растительные масла или масляные растворы витаминов (а). К раствору пленкообразователя добавляют 20% водный раствор натрия сульфата, который вызывает коацервацию желатина. Происходит образование двух жидких фаз — фазы с низким содержанием полимера и фазы с высоким содержанием полимера (б). Образование вокруг капсулируемого вещества «ожерелья» из коацерватов (в). Капли из«ожерелья» сливаются и образуют сплошную оболочку из полимера вокруг лекарственного вещества. Размер микрокапсул составляет 2—5 мкм (г). Для затвердения оболочек микрокапсул смесь быстро выливают в холодный раствор натрия сульфата. Затем микрокапсулы отфильтровывают и промывают водой для удаления раствора натрия сульфата.

Полученные микрокапсулы сушат в сушилках или водоот-нимающими средствами (этанол, формалин и др.).

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Основаны на образовании защитных покрытий вокруг ядер микрокапсулируемого вещества в результате реакций полимеризации или поликонденсации пленкообразующих компонентов.

Реакция полимеризации идет на границе жидкость — жидкость, жидкость — газ, твердое вещество — жидкость, твердое вещество — газ. Химические методы микрокапсуляции применяются для микрокапсулирования как твердых, так и жидких веществ. Процесс получения микрокапсул протекает в жидкой среде. Размеры получаемых микрокапсул можно изменять в широком диапазоне — от нескольких микрон до нескольких миллиметров, с содержанием микрокапсулирован-ного вещества до 99 %. Материал оболочки должен легко адсорбироваться на поверхности диспергированных частичек капсулируемого вещества, иначе полимер и капсулируемое вещество будут находиться в дисперсионной среде в виде отдельных составляющих.

Начальной стадией химических методов микрокапсулирования является получение эмульсий и суспензий. Выбор растворителя, материала оболочки микрокапсул определяется плотностью растворителя, его отношением к капсулируемому веществу и компонентам оболочки. Плотность дисперсионной среды должны быть близкой к плотности капсулируемого вещества (капсулируемое вещество не должно растворяться в дисперсионной среде), во избежание либо оседания, либо всплывания капсулируемого вещества. Этими методами можно получать нанокапсулы.

16.Липосомы. Определение. Характеристика. Использование в биотехнологических процессах и для создания инновационных лекарственных форм.

Впервые липосомы были использованы для включения ферментов Дж. Сесса и Дж. Вайсманом (1970). Значительный вклад в развитие этого направления принадлежит также Г. Грегориадису. Сушествует несколько способов получения липосом, содержаших включенный фермент. В олном из них раствор липида (обычно лецитина) в органнческом растворителе (напрнмер. в хлороформе) упарнвается в вакууме, и липид остается на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят водный раствор фермснта, встряхивают до полного удаления пленки липида со стенок колбы и оставляют иа некоторое времи. В полученной таким образом дисперсии липида происходит самопроизвольнос образование (самосборка) мультиламеллярных липосом, содержаших включенный фермент. Во избежанне окисления липида все операции необходимо проводить в атмосфере инертного газа.

В другом варианте метода раствор липида в органическом растворителе наслаивают на поверхность водного раствора фермента, после чего органический растворитель удаляют путем испарения в токе инертного газа, а образовавшуюся лнпидную пленку диспергируют в водном растооре. Недостаток этого способа состоит в том, что контакт с органическим растворителем может вызвать инактивацию фермента.

Для удалеиия невключившегося фермснта липосомы отделяют центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе. В случае моноламеллярных липосом, получаемых путем ультразвуковой обработки, разделение проводят методом гель-фильтрации на колонке.

Ферменты, иммобилизонанные путем включения в липосомы, применяются главным образом в медицинских целнх, а также при проведении фундаментальных исследований, поскольку такие системы близки к природным мембранам и их изучение может дать полезную информацию о ферментативных процессах в клетках.

Недавно был предложен новый способ иммобилизации ферментов путем включсния их в полимерные липосомы. Для получения липосом в этом случае используются липиды, модифицированные путем введения в их молекулу кратной связи. После включения фермента в липосомы, приготовленные из модифицированного липида обычным способом, их подвсргают облучению ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора. При этом происходит полимернзацня мономерных молекул липида с обраэованием ковалентно сшитой замкнутой липидной бислойной мембраны. ГІолнмерные липосомы обладают гораздо более высокой стабильностью по сравнению с обычными.

17.Слагаемые технологического процесса. Структура биотехнологического производства.

Биотехнология как наука базируется на использовании биологических процессов в технике и промьпнленном производстве. Эти процессы - как совокупность последовательных действий специалистов направлены на достижение соответствуюпщх результатов при эксплуатации биообъектов.

Биотехнологические процесеы можно подразделить на биологические, биохимические и биоаналогичные. К первым относят те из ких, которые основываются на использовании акариот, прокариот и эукариот, вторые – на использовании ферментов и третьи (биоаналогичные) - на химическом синтезе или полусинтезе веществ, функционально близких или эквивалентных первичным или вторичным метаболитам живых организмов (получение производных пеницнллина и цефалоспорина, тетраниклина, нуклеиновых оснований и др.).

Процессы биотехнологии подразделяют по стадиям производства:

– подготовка оборудования и питательных сред,

– стерилизания.

– посев биообъекта,

– ферментация,

– выделение целевого продукта,

– очистка целевого продукта,

– сушка и упаковка целевого продукта,

Целевыми продуктами могут быть кормовые дрожжи, первичные и вторичные метабсдиты, Подготовка оборудования, питательных сред и все другие этапы получения целевого продукта различны по многим показателям. Процесс ферменгации осуществляется в герметизированных биореакторах.

После завершения ферментации отделяют либо клетки (клеточную массу), содержащие целевой продукт, либо жидкость. Культуральная жидкость содержит биообъект, недоиспользованные компоненты питательной среды, продукты метаболизма, включая ожидаемый конечный (целевой) продукт. Полученный разбавденный раствор подвергается концентрированию путем мембранной фильтрации и вакуум–упаривания.

Основной стадией является собственно биотехнологическая стадия, на которой с использованием того или иного биологического агента (микроорганизмов, изолированных клеток, ферментов или клеточных органелл) происходит преобразование сырья в тот или иной целевой продукт.

Обычно главной задачей биотехнологической стадии является получение определенного органического вещества.

Однако биотехнологическая стадия, как правило, включает в себя не только синтез новых органических соединений, но и ряд других биотехнологических процессов, перечисленных далее.

Ферментация— процесс, осуществляемый спомощью культивирования микроорганизмов.

Биотрансформация— процесс изменения химической структуры вещества под действием ферментативной активности клеток микроорганизмов или готовых ферментов. В этом процессе обыч-но не происходит накопления клеток микроорганизмов, а химическая структура вещества меняется незначительно. Вещество как бы уже в основном готово, биотрансформация осуществляет его химическую модификацию: добавляет или отнимает радикалы, гидроксильные ионы, дегидрирует и т. п.

Биокатализ— химические превращения вещества, протекающие с использованием биокатализаторов-ферментов.

Биоокисление— потребление загрязняющих веществ с помощью микроорганизмов или ассоциации микроорганизмов в аэробных условиях.

Метановое брожение— переработка органических отходов с помощью ассоциации метаногенных микроорганизмов в анаэробных условиях.

Биокомпостирование— снижение содержания вредных органических веществ ассоциацией микроорганизмов в твердых отходах, которым придана специальная взрыхленная структура для обеспечения доступа воздуха и равномерного увлажнения.

Биосорбция— сорбция вредных примесей из газов или жидкостей микроорганизмами, обычно закрепленными на специальных твердых носителях.

Бактериальное выщелачивание— процесс перевода нерастворимых в воде соединений металлов в растворенное состояние под действием специальных микроорганизмов.

Биодеградация— деструкция вредных соединений под воздействием микроорганизмов-биодеструкторов.

Обычно биотехнологическая стадия имеет в качестве выходных потоков один жидкостной поток и один газовый, иногда только один — жидкостной. В случае, если процесс протекает в твердой фазе (например, созревание сыра или биокомпостирование отхо-дов), выходом является поток переработанного твердого продукта.