КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Присутствие белков в пищевых объектах устанавливается с помощью качественных реакций, которые условно разделяют на две группы: а) цветные реакции; б) реакции осаждения.

Среди первой группы различают универсальные реакции (биуретовая на пептидные связи и нингидриновая на α-аминокислоты) и специфические, обусловленные присутствием в белках остатков определенных аминокислот. Так, ксантопротеиновая реакция свидетельствует о наличии в белках остатков ароматических аминокислот, реакция Паули – гистидина и тирозина, Адамкевича и Вуазене – триптофана, нитропруссидная – цистеина, а реакция Сакагучи – аргинина. По результатам специфических реакций ориентировочно можно судить о пищевой ценности белков.

Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворенном состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных растворов нейтральных солей щелочных металлов и воздействии физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разрушается и они выпадают в осадок.

Так как белковые вещества сырья (муки, крупы, молока, мяса), включая ферменты, часто являются определяющими в обеспечении качества пищевых изделий, то для изучения физико-химических, биохимических и физиологических свойств этих соединений обязательным условием является получение белков в индивидуальном и, по возможности, неденатурированном состоянии. Белки обычно теряют природные (нативные) свойства (растворимость, гидратацию, ферментативную активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов.. Длительный контакт со спиртом также приводит к необратимой денатурации белка. Денатурирующее действие различных факторов на белки можно смягчить, если проводить операции выделения их при температуре не выше +4°С.

Методы выделения и очистки белков. Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагированию и собственно выделению, то есть очистке и получению белка в индивидуальном состоянии.Разрушение клеточной структуры осуществляется тщательным измельчением материала в гомогенизаторах, мельницах, попеременным замораживанием и оттаиванием, применением ультразвуковых высокочастотных колебаний, пресс-методов с использованием высоких давлений и метода "азотной бомбы". В последнем случае клетки насыщаются азотом под давлением, которое затем сбрасывается и клетки разрушаются. Эффективность гомогенизации зависит не только от способа разрушения клеточных структур, но и от вида анализируемого материала. Животные клетки разрушаются относительно легко, особенно в отсутствие сосудистой и соединительной ткани, тогда как растительные и микробные – из-за присутствия клеточных стенок – трудно. В таком случае применяют методы растирания материала с твердыми веществами (песок, абразивный порошок) или обработку клеточных стенок лизоцимом или ферментными препаратами, содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Гомогенизацию рекомендуется проводить в холодных комнатах или с использованием льда.

Экстракция белков может быть совмещена с гомогенизацией клеток и тканей либо проведена отдельно, если продукт заранее измельчен.

При изучении физико-химических свойств белков и их превращений в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различиях таких свойств белков, как размер молекул, растворимость, заряд и сродство к специфическим химическим группам.

Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяется сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность. Главную роль при высаливании играет не природа солей, а валентность ионов, действие которых оценивается по ионной силе (μ):

μ = ½ ∑CV²,

где С – концентрация каждого вида иона; V – валентность ионов.

В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству. Адсорбционнаяхроматография основана на различиях в полярности белков. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент, на который в небольшом объеме растворителя наносят исследуемый образец. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собирают с помощью автоматического коллектора фракций.

В распределительной хроматографии, в отличие от адсорбционной, в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твердой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются подлине колонки или бумаге. Распределительную хроматографию на бумаге часто используют для анализа пептидов и аминокислот. Адсорбентом служат нити целлюлозы, а растворителем – смесь органических растворителей, например: бутиловый спирт–уксусная кислота–вода. Хроматограмму проявляют, высушивают и анализируют местонахождение разделяемых компонентов тем или иным способом.

Методом ионообменной хроматографии белки или аминокислоты разделяют на основе различий в общем заряде молекул. Если белок в нейтральной среде (рН 7) имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник), если отрицательный, то – на колонке с ионообменником, представленным аминами или органическими основаниями (анионообменник). Чаще всего для фракционирования белков используют производные полистирола и целлюлозы:

Хроматография по сродству (аффинная хроматография,) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами), прикрепленными к носителю. Лиганд (глюкозу) ковалентно присоединяют к носителю (проводят иммобилизацию) и наносят на колонку исследуемую белковую смесь. Несвязавшиеся белки удаляют соответствующим буфером, а нужный белок элюируют раствором, содержащим лиганд в очень высокой концентрации. При этом присоединенные к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу, находящуюся в растворе (рис. 2.20).

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или других типов (агарозных, полистирольных). Применяются также пористые стеклянные шарики и пористый кварц (порасил). Наибольшее распространение получили декстрановые гели (сефадекс), являющиеся продуктом поперечного сшивания полисахаридных цепочек декстрана. Зерна сефадексов разных номеров содержат поры разных размеров, в которые могут проникать белки с определенной молекулярной массой. Низкомолекулярные белки распределяются в растворенном виде как внутри частиц полимера, так и между ними, а высокомолекулярные – только между частицами, поэтому вторые быстрее проходят через колонку и первыми вытекают из нее (рис. 2.21). В итоге белки распределяются по молекулярной массе и могут быть собраны в виде отдельных хроматографических

Принцип методов электрофоретического разделения заключается в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (–), передвигаться в электрическом поле с определенной скоростью. Кроме того, молекулы с близкими зарядами, но разными размерами, отличаются отношением заряда к массе. Все эти различия и обуславливают высокую разрешающую способность электрофоретических методов. Скорость миграции белков в электрическом поле (V) зависит от напряжения электрического поля(ε), заряда белков (z) и сопротивления трения (О-Сопротивление трения определяется размерами, формой белка, значениями рН и концентрацией буфера. Указанные величины связаны между собой соотношением: V = ε · z / f.

Впервые метод электрофореза был разработан Тизелиусом с применением бумаги в качестве носителя и специальных оптических устройств, регистрирующих передвижение границы раздела раствора белка и растворителя по показателям преломления (фронтальный электрофорез). В настоящее время распространены методы зонального электрофореза, предусматривающие использование крахмальных и полиакриламидных гелей (ПААГ). Наиболее распространенным методом фракционирования белков является диск-электрофорез (от англ, discontinuous – прерывистый) в ПААГ, при котором используется пара буферных растворов с различными значениями рН в присутствии ДДС-Na и гели различной пористости (концентрирующие и разделяющие) (Laemmli, 1970). Для обнаружения белков гели обрабатывают красителями: амидовым черным 10В, кумасси синим R-250. Интенсивность окраски, а по ней количественное содержание белковых фракций, определяют сканированием на денситометре.

Для электрофоретического разделения белков и пептидов успешно применяется двумерный электрофорез в ПААГ. В соответствии с этим методом смесь компонентов разделяют сначала в столбиках геля электрофорезом в горизонтальном направлении, затем в гелевых пластинах – в вертикальном (рис. 2.23). При разделении белков, например гороха, этим методом удалось получить более 150 различных компонентов.

Очень высокую разрешающую способность имеет метод изоэлектрического фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения. Колонку предварительно заполняют носителями с синтетическими смесями полиаминополикарбоновых кислот (амфолитами), затем сверху в нее подают раствор сильной кислоты, снизу – сильнощелочной раствор для того, чтобы установить градиент рН с крайними значениями, соответствующими рН кислого и щелочного растворов. Амфолиты прекращают движение по колонке, когда их суммарный заряд становится равным нулю, и тем самым стабилизируют исходный градиент рН. В подготовленную колонку вносят образец исследуемой смеси, компоненты которой распределяются по зонам со значениями рН, характерными их изоэлектрическим точкам.

В химии пищевого белка применяют и другие разновидности ектрофоретическогоразделения(иммуноэлектрофорез, изотахофорез), а также метод пептидных карт и ультрацентрифугирование. Метод пептидных карт (отпечатков пальцев) относится к методам двумерного разделения и наиболее часто используется для анализа пептидов. Пептиды получают избирательным гидролизом белков, затем на бумаге их разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном – распределительной хроматографией. Пептиды окрашивают нингидрином, элюируют и определяют аминокислотный состав.

В методе ультрафильтрации белки в градиенте плотности распределяются на разных уровнях центрифужной пробирки в процессе седиментации (осаждения) в виде отдельных зон. Для создания градиента используют соли тяжелых металлов и растворы сахарозы. Метод широко применяется для определения молекулярных масс белков по константе седиментации (S), которая зависит от массы и формы белковых частиц:

S = v/(w² · r),

где v – скорость перемещения границы растворитель–белок, см/с; w– угловая скорость ротора, рад/с; г – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка.

Величина S, равная 1 · 10^-13 с, принята за единицу и названа сведбергом (S) в честь Т. Сведберга, впервые сконструировавшего ультрацентрифугу.

Очистка белков от низкомолекулярных соединений (солей, сахаров, аминокислот) осуществляется методами диализа, гель-фильтрации на сефадексе G-25, кристаллизации, ультрафильтрации и с помощью полых волокон. При диализе используют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), через которые белки не диффундируют и остаются внутри диализного мешочка. Более мелкие молекулы проходят через поры диализной мембраны и выходят в диализат. В методе ультрафильтрации, который применяется, например, в производстве сывороточных белков молока, соевых белковых изолятов, по обе стороны мембраны создается разность давлений за счет продавливания фильтруемого белкового раствора. В качестве мембран используются целлюлозные пленки и нецеллюлозные полиэлектролитные комплексы. Аналогично мембранам по принципу молекулярного сита действуют и полые волокна. Белковый раствор помещается с внешней стороны волокон, и создается разность давления за счет повышения его в растворе или понижения внутри их.

Гомогенность белка определяется на последнем этапе выделения и очистки с применением по меньшей мере двух методов, оценивающих то или иное физико-химическое свойство. Наиболее достоверными являются ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в ПААГ, иммунохимические методы и растворимость. Если белок при электрофорезе представлен только одной полосой и обладает при этом максимальной биологической активностью, то он считается гомогенным. Для гомогенного белка на кривой растворимости (зависимости растворенного белка от общего его количества в постоянном объеме растворителя) имеется только один перегиб, тогда как для гетерогенного – столько, сколько в нем индивидуальных компонентов.

Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки (1983) неоднократно модифицировался с применением различных катализаторов и условий минерализации. На основе модифицированных методов созданы высокопроизводительные автоматические анализаторы типа "Кьельфос", стоимость определения содержания белка на которых и сегодня остается высокой. Существует и некоторая условность в методе Кьельдаля при расчете количества белка, заключающаяся в использовании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля является унифицированным, он включен в ГОСТы на многие пищевые продукты.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16% азота (100/6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как ее белки содержат 17,5% азота. Для других белковых ресурсов коэффициенты перевода приняты следующими: 5,7 – рожь, ячмень, овес, семена подсолнечника; 5,8 – соя; 6,25 – кукуруза, мясо; 6,38 – молоко.

Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе "Техникон". Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота (N₂). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа ¹³N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе "Техникон" осуществляется колориметрическим способом, в котором измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции взаимодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерализации образца, с щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все описанные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури – восстановление фосфомолибденовой кислоты тирозином и триптофаном с одновременным протеканием биуретовой реакции. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах.