Генная инженерия бактерий
Генетическая рекомбинация заключается в обмене генами между двумя хромосомами. Обмен генами и введение в клетку гена, принадлежащего другому виду, можно осуществить посредством генетической рекомбинации. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на кишечной палочке, в клетки которой вводили гены животных, человека и добивались их репликации (размножения). Выделение фрагментов ДНК в хромосомах, несущих гены с необходимыми свойствами, производят с помощью вырабатываемых клетками бактерий ферментов рестрикции (рестриктаз).В клетках кишечной палочки и других бактерий были обнаружены ферменты, разрезающие на куски ДНК вирусов и других фагов (там где расположены специфические последовательности нуклеотидов), и тем самым защищающие клетку от разрушения.
Рестриктазыраспознают в ДНК специфичные для них участки длиной в 4-6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются обрывки с ровными (тупыми) концами, во втором - стороны оборванных цепочек ДНК чуть-чуть заходят одна за другую. Такие концы называются липкими, они могут слипаться между собой в силу комплиментарности.
Скрепить липкие концы помогает ДНК-лигаза,сшивающая фосфодиэфирные связи.
Для кодирования среднего белка из 400 аминокислот нужен участок ДНК длиной 1200 пар нуклеотидов. В России и за рубежом из различных бактерий выделено несколько сотен рестриктаз, разрезающих ДНК в строго определенных местах, там, где фермент прикреплялся. При этом было установлено, что концы фрагментов ДНК, полученные с помощью обработки хромосом одной и той же рестриктазой, способны слипаться между собой в силу комплиментарности. Две совершенно не схожие между собой последовательности ДНК (например, слона и лягушки) образуют одинаковые липкие концы, если эти ДНК обработать одной и той же рестриктазой. В настоящее время известно более 500 рестриктаз, способных рубить ДНК в120 различных последовательностях. Это дало возможность получать фрагменты ДНК, содержащие желаемые гены. Участки ДНК, разрезаемые рестриктазами, несложно разделить с помощью электрофореза. ДНК, обработанную рестриктазой, вводят в гель агарозы, помещенной в электрическое поле. Под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться в пористом геле. Короткие фрагменты движутся быстрее, чем длинные, они отделяются друг от друга, не повреждаются и не утрачивают биологических свойств. Скрепить сцепившиеся липкие концы фрагментов разных ДНК помогает фермент ДНК-лигаза.Она сшивает фрагменты с образованием полной структуры двойной спирали ДНК.
Следующей задачей было создание функционально активных, способных реплицироваться гибридных ДНК. С этой целью интересующий фрагмент ДНК включают в состав вектора, с помощью которого он может быть размножен. Вектор- это молекула ДНК, способная переносить в клетку чужеродную ДНК любого происхождения и обеспечивать там ее размножение. Клетки, в которые вектор переносит вшитый в него ген, получили название реципиентов.
В качестве векторов чаще всего используют плазмиды бактерий. Главное свойствоплазмид состоит в их способности реплицироваться независимо от хромосомы. По размеру ДНК плазмиды в 100 раз меньше ДНК бактериальной хромосомы. В плазмиде таких размеров все же может разместиться до сотни генов.
Плазмиды повышают устойчивость бактерий к внешним факторам, защищают их от неблагоприятных воздействий.
Выяснилось, что многие мелкие плазмиды содержат по одному участку для нескольких рестриктаз. Каждая такая рестриктаза не разорвет плазмиду на несколько мелких кусков, а лишь разрежет кольцо плазмидной ДНК и переведет ее в линейное состояние. Первая такая плазмида была открыта английским ученым Стэнли Коуэном в 1974 г.,которую он назвал своим именем.Она самостоятельно размножается. Концы ее способны слипаться между собой или с любыми фрагментами другой ДНК, получаемыми под действием той же рестриктазы. Несет ген устойчивости к тетрациклину и легко обнаруживается при выращивании на среде с антибиотиком.
Следующая проблема - заставить клетку воспринять рекомбинантную ДНК. Объектом первых опытов по генной инженерии была избрана кишечная палочка Е.сoli.Клетки кишечной палочки выдерживают на холоде в растворе кальция, затем подвергают «тепловому шоку». После этого клеточная мембрана становится проницаемой для поступления извне молекул ДНК. В плазмиду была включена группа генов из хромосомы Е.сoli,ответственных за синтез аминокислоты триптофана. Когда в клетки Е.сoliввели гибридную ДНК, они стали вырабатывать столько ферментов, участвующих в биосинтезе этой аминокислоты, что бактерии превратились в фабрику по производству триптофана.
Помимо плазмид, в качестве векторов стали использовать и ДНК вирусов, размножающихся в клетках бактерий. Клетка, получившая гибридную ДНК, размножившись, образует клон. Это открыло путь для производства различных белков, лекарственных препаратов, гормонов, путем искусственногосинтеза их генов и вставки их в клетки с помощью плазмид. Важнейший из них -инсулин, получаемый из поджелудочной железы свиней.
Дата добавления: 2016-03-27; просмотров: 2622;