ИОННЫЙ МЕХАНИЗМ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛА ДЕЙСТВИЯ

В основе потенциала действия лежат последовательно развивающиеся во времени изменения ионной проницаемости клеточной мембраны.

Как отмечалось, в состоянии покоя проницаемость мембраны для калия превышает ее проницаемость для натрия. Вследствие этого поток К'⁺ из цитоплазмы во внешний раствор превышает противоположно направленный поток Na⁺ Поэтому наружная сто­рона мембраны в покое имеет положительный потенциал по отношению к внутренней.

При действии на клетку раздражителя проницаемость мембраны для Na⁺ резко повышается и в конечном итоге становится примерно в 20 раз больше проницаемости для К'⁺. Поэтому поток Na⁺ из внешнего раствора в цитоплазму начинает превышать

направленный наружу калиевый ток. Это приводит к изменению знака (реверсии) мембранного потенциала: внутреннее со­держимое клетки становится заряжен­ным положительно по отношению к ее на­ружной поверхности. Указанное измене­ние мембранного потенциала соответст­вует восходящей фазе потенциала дейст­вия (фаза деполяризации).

Повышение проницаемости мембра­ны для Na⁺ продолжается лишь очень короткое время. Вслед за этим проницае­мость мембраны для Na⁺ вновь понижа­ется, а для К⁺ возрастает.

Процесс, ведущий к понижению ра­нее увеличенной натриевой проницаемос­ти мембраны, назван натриевой инактивацией. В результате инактивации поток Na⁺ внутрь цитоплазмы резко ослабляет­ся. Увеличение же калиевой проницаемо­сти вызывает усиление потока К⁺ из цитоплазмы во внешний раствор. В итоге этих двух процессов и происходит реполяризация мембраны: внутреннее содержимое клетки вновь приобретает отрицательный заряд по отношению к наружному раствору. Этому измене­нию потенциала соответствует нисходящая фаза потенциала действия (фаза реполяризации).

Одним из важных аргументов в пользу натриевой теории происхождения потенциалов дей­ствия был факт тесной зависимости его амплитуды от концентрации Na⁺ во внешнем растворе. Опыты на гигантских нервных волокнах, перфузируемых изнутри солевыми растворами, позволили получить прямое подтверждение правильности натриевой теории. Установлено, что при замене аксоплазмы солевым раствором, богатым К⁺, мембрана волокна не только удерживает нормальный потенциал покоя, но в течение длительного времени сохраняет способность генерировать сотни тысяч потенциалов действия нормальной амплитуды. Если же К⁺ во внутриклеточном растворе частично заменить на Na⁺ и тем самым снизить градиент концентрации Nа⁺ между наружной сре­дой и внутренним раствором, амплитуда потенциала действия резко понижается. При полной замене К⁺ на Na⁺ волокно утрачивает способность генерировать потенциалы действия.

Эти опыты не оставляют сомнения в том, что поверхностная мембрана действительно является местом возникновения потенциала как в покое, так и при возбуждении. Становится очевидным, что разность концентраций Nа⁺ и К⁺ внутри и вне волокна является источником электродвижущей силы, обусловливающей возникновение потенциала покоя и потенциала действия.

На рис. 6 показаны изменения натриевой и калиевой проницаемости мембраны во время генерации потенциала действия в гигантском аксоне кальмара. Аналогичные отно­шения имеют место в других нервных волокнах, телах нервных клеток, а также в скелет­ных мышечных волокнах позвоночных животных. В скелетных мышцах ракообразных животных и гладких мышцах позвоночных в генезе восходящей фазы потенциала дейст­вия ведущую роль играют ионы Са²⁺. В клетках миокарда начальный подъем потен­циала действия связан с повышением проницаемости мембраны для Nа⁺, а плато по­тенциала действия обусловлено повышением проницаемости мембраны и для ионов Са²⁺

О ПРИРОДЕ ИОННОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАНЫ. ИОННЫЕ КАНАЛЫ

В основе рассмотренных изменений ионной проницаемости мембраны при генерации потенциала действия лежат процессы открывания и закрывания специализированных ионных каналов в мембране, обладающих двумя важнейшими свойствами: 1) избира­тельностью (селективностью) по отношению к определенным ионам; 2) электровозбудимостью, т. е. способностью открываться и закрываться в ответ на изменения мембранного потенциала. Процесс открывания и закрывания канала имеет вероятностный характер (мембранный потенциал лишь определяет вероятность нахождения канала в открытом или закрытом состоянии).

Так же как ионные насосы, ионные каналы образованы макромолекулами белков, пронизы­вающими липидный бислой мембраны. Химическая структура этих макромолекул еще на расшифро­вана, поэтому представления о функциональной организации каналов строятся пока главным обра­зом косвенно — на основании анализа данных, полученных при исследованиях электрических яв­лений в мембранах и влияния на каналы различных химических агентов (токсинов, ферментов, лекарственных веществ и т. д.). Принято считать, что ионный канал состоит из собственно транс­портной системы и так называемого воротного механизма («ворот»), управляемого электрическим полем мембраны. «Ворота» могут находиться в двух положениях: они полностью закрыты или пол­ностью открыты, поэтому проводимость одиночного открытого канала — постоянная величина. Суммарная проводимость мембраны для того или иного иона определяется числом одновременно открытых каналов, проницаемых для данного иона.

Это положение может быть записано следующим образом:

где g_i — суммарная проницаемость мембраны для внутриклеточного иона; N — общее число соот­ветствующих ионных каналов (в данном участке мембраны); а—доля открытых каналов; у— проводимость одиночного канала.

По своей селективности электровозбудимые ионные каналы нервных и мышечных клеток под­разделяются на натриевые, калиевые, кальциевые, хлорные. Селективность эта не абсолютная:

название канала указывает лишь ион, для которого данный канал наиболее проницаем.

Через открытые каналы ионы движутся по концентрационному и электрическому градиентам. Эти потоки ионов приводят к изменениям мембранного потенциала, что в свою очередь изменяет среднее число открытых каналов и соответственно величину ион­ных токов и т. д. Такая круговая связь важна для генерации потенциала действия, но она делает невозможным количественную оценку зависимости ионных проводимостей от величины генерируемого потенциала. Для изучения этой зависимости применяется «метод фиксации потенциала». Сущность данного метода состоит в насильственном под­держании мембранного потенциала на любом заданном уровне. Так, подавая на мембра­ну ток, равный по величине, но обратный по знаку ионному току, проходящему через открытые каналы, и измеряя этот ток при различных потенциалах, исследователи полу­чают возможность проследить зависимость потенциала от ионных проводимостей мем

Рис. 7. Временной ход изменений натриевой (§ма) и калиевой (g^) проницаемости мембраны при де­поляризации мембраны аксона на 56 мВ.

а — сплошные линии показывают проницаемость при длительной деполяризации, а пунктирные — при репо-ляризации мембраны через 0,6 и 6,3 мс; б — зависимость пиковой величины натриевой (gNa) ^и стационарного уровня калиевой (gx) проницаемости от мембранного потенциала.

Рис. 8. Схематическое изображение электровозбудимого натриевого канала.

Канал (1) образован макромолекулой белка 2), суженная часть которого соответствует «селективному фильтру». В канале имеются активационные (т) и инактивационные (h) «ворота», которые управляются электрическим полем мембраны. При потенциале покоя (а) наиболее вероятным является положение «закры­то» для активационных ворот и положение «открыто» для инактивационных. Деполяризация мембраны (б) приводит к быстрому открыванию т-«ворот» и медленному закрыванию п-«ворот», поэтому в начальный момент деполяризации обе пары «ворот» оказываются открытыми и через канал могут двигаться ионы в соот­ветствии с их концентрационными и электрическими градиентами. При продолжающейся деполяризации (о) инактивационные «ворота» закрываются и канал переходит в состояние инактивицин.

браны. Чтобы из общего ионного тока, протекающего через мембрану, выделить его ком­поненты, соответствующие потокам ионов, например, через натриевые каналы, исполь­зуют химические агенты, специфически блокирующие все другие каналы. Соответствен­ным образом поступают при измерениях калиевого или кальциевого токов.

На рис. 7 показаны изменения натриевой (g_Na) и калиевой (g_k) проницаемости мембраны нервного волокна во время фиксированной деполяризации. Как отмечалось, величины g_Na и g_K отражают число одновременно открытых натриевых или калиевых кана­лов. Как видно, g_Na быстро, за доли миллисекунды, достигла максимума, а затем медлен­но начала снижаться до исходного уровня. После окончания деполяризации способность натриевых каналов вновь открываться постепенно восстанавливается в течение десятков миллисекунд.

Рис. 9. Состояние натриевых и калиевых ка­налов в различные фазы потенциалов дей­ствия (схема). Объяснение в тексте.

Для объяснения такого поведения натрие­вых каналов высказано предположение о суще­ствовании в каждом канале двух типов «во­рот» — быстрых активационных и медленных инактивационных. Как следует из названия, на­чальный подъем g_Na связан с открыванием активационных ворот («процесс активации»), последующее падение g_Na, во время продолжа­ющейся деполяризации мембраны, — с закры­ванием инактивационных ворот («процесс инактивации»).

На рис. 8, 9 схематически изображена организа­ция натриевого канала, облегчающая понимание его функций. Канал имеет наружное и внутреннее расши­рения («устья») и короткий суженный участок, так называемый селективный фильтр, в котором происхо­дит «отбор» катионов по их размеру и свойствам. Судя по размеру наибольшего проникающего через натриевый канал катиона, отверстие фильтра не меньше 0,3—0,5 нм. При прохождении через фильтр ионы Na⁺ теряют часть, своей гидратной оболочки. Активационные (m) и инактивационные (h) «ворота» расположены в области внутреннего конца натриевого канала, причем «ворота» h обращены в сторону цитоплазмы. К такому заключению пришли на основании того факта, что приложение неко­торых протеолитических ферментов (проназы) к внутренней стороне мембраны приводит к устра­нению натриевой инактивации (разрушает h-«ворота»),

В состоянии покоя «ворота» т закрыты, тогда как «ворота» h открыты. При деполяризации в начальный момент «ворота» т и h открыты — канал находится в проводящем состоянии. Затем инактивационные ворота закрываются — канал инактивируется. После окончания деполяризации «ворота» h медленно открываются, а «ворота» т быстро закрываются и канал возвращается в исход­ное покоящееся состояние.

Специфическим блокатором натриевых каналов является тетродотоксин,— соедине­ние, синтезируемое в тканях некоторых видов рыб и саламандр. Это соединение входит в наружное устье канала, связывается с какими-то пока неидентифицированными хими­ческими группами и «закупоривает» канал. Используя радиоактивно меченный тетродо­токсин, подсчитали плотность натриевых каналов в мембране. У различных клеток эта плотность варьирует от десятков до десятков тысяч натриевых каналов на квадратный микрон мембраны.

Функциональная организация калиевых каналов сходна с таковой натриевых кана­лов, различия лишь в их селективности и кинетике процессов активации и инактивации. Селективность калиевых каналов выше селективности натриевых: для Na⁴' калиевые каналы практически непроницаемы; диаметр их селективного фильтра около 0,3 нм. Акти­вация калиевых каналов имеет примерно на порядок более медленную кинетику, чем активация натриевых каналов (см. рис. 7). На протяжении 10 мс деполяризации g_K, не об­наруживает тенденции к инактивации: калиевая инактивация развивается только при многосекундной деполяризации мембраны.

Следует подчеркнуть, что такие соотношения между процессами активации и инактивации калиевых каналов характерны только для нервных волокон. В мембране многих нервных и мышечных клеток существуют калиевые каналы, которые сравнительно быстро инактивируются. Обнаружены также быстро активирующиеся калиевые каналы. Наконец, существуют калиевые каналы, которые активируются не мембранным потенциалом, а внутриклеточным Са²⁺.

Калиевые каналы блокируются органическим катионом тетраэтиламмонием, а так­же аминопиридинами.

Кальциевые каналы характеризуются медленной кинетикой процессов активации (миллисекунды) и инактивации (десятки и сотни миллисекунд). Их селективность оп­ределяется наличием в области наружного устья каких-то химических групп, обладаю­щих повышенным сродством к двухвалентным катионам: Са²⁺ связывается с этими груп­пами и только после этого проходит в полость канала. Для некоторых двухвалентных катионов сродство к указанным группам настолько велико, что, связываясь с ними, они блокируют движение Са²⁺ через канал. Так действует Mn²⁺. Кальциевые каналы мо­гут быть блокированы также некоторыми органическими соединениями (верапамил, нифедипин), используемыми в клинической практике для подавления повышенной элек­трической активности гладких мышц.

Характерная особенность кальциевых каналов — их зависимость от метаболизма и, в частности, от циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ), регулирующих процессы фосфорилирования и дефосфорилирования белков кальциевых каналов.

Скорость процессов активации и инактивации всех ионных каналов увеличивается с возрастанием деполяризации мембраны; соответственно увеличивается до некоторой предельной величины число одновременно открытых каналов.

МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЯ ИОННОЙ ПРОВОДИМОСТИ ВО ВРЕМЯ ГЕНЕРАЦИИ ПОТЕНЦИАЛА ДЕЙСТВИЯ

Известно, что восходящая фаза потенциала действия связана с повышением натрие­вой проницаемости. Процесс повышения g_Na развивается следующим образом.

В ответ на начальную деполяризацию мембраны, вызванную раздражителем, откры­вается лишь небольшое число натриевых каналов. Их открывание, однако, приводит к возникновению входящего внутрь клетки потока ионов Na⁺ (входящий натриевый ток), который увеличивает начальную деполяризацию. Это ведет к открыванию новых натрие­вых каналов, т. е. к дальнейшему повышению g_Na соответственно входящего натриевого тока, а следовательно, к дальнейшей деполяризации мембраны, что, в свою очередь, обусловливает еще большее повышение g_Na и т. д. Такой круговой лавинообразный процесс получил название регенеративной (т. е. самообновляющейся) деполяризации. Схематически он может быть изображен следующим образом:

Теоретически регенеративная деполяризация должна была бы завершаться повыше­нием внутреннего потенциала клетки до величины равновесного нернстовского потен­циала для ионов Na⁺:

где Na_o⁺— наружная, a Na_i⁺ — внутренняя концентрация ионов Na⁺

При наблюдаемом соотношение

Эта величина является предельной для потенциала действия. В действительности, однако, пиковый потенциал никогда не достигает величины Е_Na, во-первых, потому, что мембрана в момент пика потенциала действия проницаема не только для ионов Na⁺, но и для ионов K⁺ (в значительно меньшей степени). Во-вторых, подъему потенциала действия до величины Е_Na противодействуют восстановительные процессы, ведущие к восстановлению исходной поляризации (реполяризация мембраны).

Такими процессами являются снижение значения g_Na и повышение уровня g_K

Снижение g_Na обусловлено тем, что активация натриевых каналов во время деполя­ризации сменяется их инактивацией; это приводит к быстрому уменьшению числа откры­тых натриевых каналов. Одновременно под влиянием деполяризации начинается медлен­ная активация калиевых каналов, обусловливающая рост значения g_K. Следствием увели­чения g_K является усиление выходящего из клетки потока ионов K⁺ (выходящий калие­вый ток).

В условиях понижения g_Na, связанного с инактивацией натриевых каналов, выходя­щий ток ионов K⁺ приводит к реполяризации мембраны или даже к ее временной («сле­довой») гиперполяризации, как это имеет место, например, в гигантском аксоне кальмара (см. рис. 4).

Реполяризация мембраны в свою очередь ведет к закрыванию калиевых каналов' и, следовательно, ослаблению выходящего калиевого тока. Вместе с тем под влиянием реполяризации происходит медленное устранение натриевой инактивации: открываются инактивационные ворота и натриевые каналы возвращаются в состояние покоя.

На рис. 9 схематически показано состояние натриевых и калиевых каналов в различ­ные фазы развития потенциала действия.

Все агенты, блокирующие натриевые каналы (тетродотоксин, местные анестетики и многие другие препараты), снижают крутизну нарастания и амплитуду потенциала дей­ствия и тем в большей степени, чем выше концентрация этих веществ.

Обмен веществ Внутри: Na мало К много

АКТИВАЦИЯ НАТРИЙ-КАЛИЕВОГО НАСОСА ПРИ ВОЗБУЖДЕНИИ

Возникновение серии импульсов в нервном или мышечном волокне сопровождается обогащением протоплазмы Na⁺ и потерей K⁺. Для гигантского аксона кальмара диамет­ром 0,5 мм подсчитано, что во время одиночного нервного импульса через каждый квадратный микрон мембраны в протоплазму поступает около 20 000 Na⁺ и столько же K⁺ покидает волокно. В итоге при каждом импульсе аксон теряет около одной миллион­ной общего содержания калия. Хотя эти потери очень незначительны, при ритмическом следовании импульсов, суммируясь, они должны были бы привести к более или менее заметным изменениям концентрационных градиентов.

Особенно быстро такие концентрационные сдвиги должны были бы развиваться в тонких нервных и мышечных волокнах и мелких нервных клетках, обладающих малым по отношению к поверхности объемом цитоплазмы. Этому, однако, противодействует натриевый насос, активность которого возрастает при повышении внутриклеточной кон­центрации ионов Na⁺.

Усиление работы насоса сопровождается значительным повышением интенсивности обменных процессов, поставляющих энергию для активного переноса ионов Na⁺ и K⁺ через мембрану. Это проявляется усилением процессов распада и синтеза АТФ и креатин-фосфата, увеличением потребления клеткой кислорода, повышением теплопродукции и т. п.

Благодаря работе насоса нарушенное при возбуждении неравенство концентраций Na⁺ и K⁺ по обе стороны мембраны полностью восстанавливается. Следует, однако, подчеркнуть, что скорость выведения Na⁺ из цитоплазмы с помощью насоса относительно мала: она примерно в 200 раз ниже скорости движения этих ионов через мембрану по концентрационному градиенту.

Таким образом, в живой клетке существует две системы движения ионов через мембрану (рис. 10). Один из них осуществляется по градиенту концентрации ионов и не требует затраты энергии, поэтому его называют пассивным ионным транспортом. Он ответствен за возникновение потенциала покоя и потенциала действия и ведет в конечном итоге к выравниванию концентрации ионов по обе стороны клеточной мембраны. Второй тип движения ионов через мембрану, осуществляющийся против концентрационного гра­диента, состоит в «выкачивании» ионов натрия из цитоплазмы и «нагнетании» ионов калия внутрь клетки. Этот тип ионного транспорта возможен лишь при условии затраты энергии обмена веществ. Его называют активным ионным транспортом. Он ответствен за поддержание постоянства разности концентраций ионов между цитоплазмой и омы­вающей клетку жидкостью. Активный транспорт — результат работы натриевого насоса, благодаря которому восстанавливается исходная разность ионных концентраций, нару­шающаяся при каждой вспышке возбуждения.

Рис.10. Две системы транспорта ионов через мембрану.

Справа — движение ионов Na⁺ и K⁺ по ионным каналам во время возбуждения в соответствии с концентрационным и электрическим градиентами. Слева — активный транспорт ионов против концен­трационного градиента за счет энергии метаболиз­ма («натриевый насос»). Активный транспорт обес­печивает поддержание и восстановление ионных градиентов, изменяющихся во время импульсной активности. Пунктирной линией обозначена та часть оттока Na⁺ которая не исчезает при удале­нии из наружного раствора ионов K⁺ [Ходжкин А., 1965].

МЕХАНИЗМ РАЗДРАЖЕНИЯ КЛЕТКИ (ВОЛОКНА) ЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ТОКОМ

В естественных условиях генерацию потенциала действия вызывают так называемые местные токи, возникающие между возбужденным (деполяризованным) и покоящимся участками клеточной мембраны. Поэтому электрический ток рассматривается как аде­кватный раздражитель для возбудимых мембран и успешно используется в эксперимен­тах при изучении закономерностей возникновения потенциалов действия.

Минимальную силу тока, необходимую и достаточную для инициации потенциала действия, называют пороговой, соответственно раздражители большей и меньшей силы обозначают подпороговыми и сверхпороговыми. Пороговая сила тока (пороговый ток) в определенных пределах находится в обратной зависимости от длительности его дейст­вия. Существует также некоторая минимальная крутизна нарастания силы тока, ниже которой последний утрачивает способность вызывать потенциал действия.

Существуют два способа подведения тока к тканям для измерения порога раздражения и, следовательно, для определения их возбудимости. При первом способе — внеклеточном — оба электрода располагают на поверхности раздражаемой ткани. Условно принимают, что приложен­ный ток входит в ткань в области анода и выходит в области катода (рис. 11). Недостаток этого метода измерения порога заключается в значительном ветвлении тока: только часть его проходит через мембраны клеток, часть же ответвляется в межклеточные щели. .Вследствие этого при раз­дражении приходится применять ток значительно большей силы, чем необходимо для возникновения возбуждения.

При втором способе подведения тока к клеткам — внутриклеточном — микроэлектрод вводят в клетку, а обычный электрод прикладывают к поверхности ткани (рис. 12). В этом случае весь ток проходит через мембрану клетки, что позволяет точно определить наименьшую силу тока, необходи­мую для возникновения потенциала действия. При таком способе раздражения отведение потен­циалов производят с помощью второго внутриклеточного микроэлектрода.

Пороговая сила тока, необходимая для возникновения возбуждения различных клеток при внутриклеточном раздражающем электроде, равна Ю^-7— 10^-9 А.

В лабораторных условиях и при .проведении некоторых клинических исследований для раз­дражения нервов и мышц применяют электрические стимулы различной формы: прямоугольной, синусоидальной, линейно и экспоненциально нарастающей, индукционные удары, конденсаторные разряды и т. п.

Механизм раздражающего действия тока при всех видах стимулов в принципе оди­наков, однако в наиболее отчетливой форме он выявляется при использовании постоян­ного тока.

Рис.11. Ветвление тока в ткани при раздра­жении через наружные (внеклеточные) электроды (схема).

Мышечные волокна заштрихованы, между ни­ми — межклеточные щели.

Рис.12. Раздражение и отведение потенци­алов через внутриклеточные микроэлектро­ды. Объяснение в тексте.

ДЕЙСТВИЕ ПОСТОЯННОГО ТОКА НА ВОЗБУДИМЫЕ ТКАНИ