Зачем нужна биохимия?

Когда в 1929 году физиолог-любитель из Швейцарии Ганс Бергер описал, как с помощью набора электродов, закрепленных на голове человека, ему удалось зарегистрировать непрерывные вспышки электрической активности в мозгу, никто сначала не принял это сообщение всерьез. Обсуждая аналогии памяти, я уже упомянул феномен «животного электричества» и его связь с нервной активностью; он был известен очень давно, по крайней мере с того времени, как в 1790-х годах Гальвани продемонстрировал в Болонье, как электрические разряды вызывают подергивание лапок лягушки. В 1875 году Кейтон, профессор физиологии из Ливерпуля, показал, что электроды, приложенные к обнаженному мозгу кроликов, регистрируют электрические импульсы. Однако Бергер выявлял импульсы, проходящие через кости черепа, поэтому их вполне можно было бы счесть артефактом, если бы в середине тридцатых годов нашего века кембриджские нейрофизиологи Эдриан и Мэттьюз не подтвердили эти наблюдения в систематических исследованиях. Непрерывная электрическая активность мозга носила характер своеобразных волн, различавшихся во время сна и бодрствования, в периоды умственного напряжения и покоя.

Одно время казалось, что тайны души заключаются в изменчивых линиях электроэнцефалограммы (ЭЭГ) [1]. Нельзя ли найти в них и ключ к механизмам памяти? Быть может, воспоминания хранятся в форме непрерывно реверберирующих цепей, электрических контуров, создающихся в результате замыкания и размыкания различных синаптических соединений? Увы, недолгая популярность этой идеи не выдержала испытания: как показали исследования, долговременная память сохраняется даже после дезорганизации всей электрической активности мозга (например, при электрошоке или припадке эпилепсии) или почти полного ее прекращения, как при коме или сотрясении мозга. Поэтому, не исключая зависимости самых кратковременных фаз памяти от непрерывной электрической активности мозга (о чем в свое время будет сказано подробнее), следует подчеркнуть, что любой сколько-нибудь длительный след памяти должен быть воплощен в каком-то более стойком изменении.

Какую, однако, форму могут иметь такие следы и на каких уровнях их надо искать? Согласно концепции Хебба, изложенной в главе 6, формирование следов памяти связано с ростом или перестройкой синапсов - процессом, приводящим к построению новой системы межнейронных связей, которые могут в дальнейшем сохраняться. Эта гипотеза получила широкое признание, хотя отнюдь не остается единственной. Сколько же синапсов и нейронов может соответствовать одному простейшему следу? И что такое «простейший след»? Можно ли сказать: «одна ассоциация - один синапс»? Или в ассоциации участвует сразу много клеток и синапсов? Находятся ли эти клетки и синапсы в определенном участке мозга или разбросаны по разным областям? Не повторяется ли каждый след многократно? Споры относительно локализации отражают противоречивость данных, полученных при изучении мозга, и попыток интерпретации их на клеточном уровне. Заключены ли воспоминания постоянно в одном и том же наборе клеток, или же их сохранение - более динамичный процесс? Все эти вопросы остаются пока без ответа даже в рамках концепции Хебба, и их решение поможет выяснить, на каком уровне клеточной организации мозга представлены следы памяти.

Чтобы ответить на эти вопросы, необходимо также создать экспериментальные модели для проверки различных гипотез и достаточно точные методы, которые позволили бы выявлять и измерять предполагаемые изменения. До самого последнего времени невероятной казалась сама мысль использовать микроскопическую технику, чтобы наблюдать изменения в структуре нейронов и синапсов, происходящие при научении, - хотя бы потому, что для этого надо хорошо представлять себе, в какой части мозга следует вести поиски и что именно измерять. Возможен, однако, иной подход: если научение действительно связано со структурными изменениями в синапсах, а синапсы построены из белков и набиты молекулами нейромедиаторов, то оно должно сопровождаться синтезом новых белков и медиаторов. Так не проще ли измерять процессы биосинтеза, чем пытаться непосредственно выявить структурные изменения?

Синтез белка

Живые организмы значительно более постоянны, чем составляющие их молекулы. Ни одна молекула в нашем теле не остается неизменной дольше нескольких недель или месяцев. На протяжении этого периода даже во взрослом организме молекулы синтезируются, выполняют свою роль в жизни клетки, а потом отбрасываются за ненадобностью, разрушаются и заменяются другими более или менее идентичными молекулами. Самое удивительное в этом безостановочном круговороте то, что строение клеток и всего тела, которые состоят из этих молекул, остается неизменным, несмотря на замену отдельных компонентов. В этом смысле недостаточно даже сравнение с автомобилем, в котором так часто выбрасывают прохудившийся глушитель, дефектную свечу или часть кузова, заменяя их новыми деталями. Тело лучше сравнить с кирпичной постройкой, из которой сумасшедший каменщик непрерывно, ночью и днем вынимает один кирпич за другим и вставляет на их место новые. При этом наружный вид постройки остается прежним, хотя материал постоянно заменяется. Белковые молекулы тела тоже заменяются («оборачиваются»), подобно кирпичам постройки, таким образом, что в среднем каждые две недели их состав обновляется наполовину. Синтез новой белковой молекулы занимает несколько минут. Образовавшаяся молекула переносится в ту часть клетки, где она нужна, и остается там на протяжении часов, недель или месяцев, пока не приходит время замены; тогда молекула покидает свое место в клетке и разрушается ферментами так же быстро, как некогда образовалась, а компоненты, из которых она построена (аминокислоты), повторно используются для синтеза других белков. В нормальных условиях скорость биосинтеза и распада белков во взрослом организме одинакова. Когда в конструкцию включается один новый кирпичик, из нее изымается в среднем один старый. Предположим, однако, что решено пристроить к вашему дому еще одну печную трубу. Для этого нужно на какое-то время увеличить скорость кладки в определенном месте строения - на крыше, не изменяя скорость выемки кирпичей; тогда их общее количество в постройке по мере наращивания трубы будет увеличиваться. После того как труба готова, скорость кладки можно опять понизить до первоначальной, уравняв ее со скоростью выемки. В результате такого кратковременного изменения режима работы у вас будет дом с трубой, который придется поддерживать так же, как до ее постройки. Именно так обстоит дело с синапсами. Если в процессе обучения они действительно возникают заново или перестраиваются, то в этот период можно ожидать ускорения белкового синтеза. И наоборот, если при запоминании требуется синтез белка для построения синапсов, то, остановив этот синтез на время обучения, можно будет блокировать образование новых следов: животное, обучавшееся выполнять определенную задачу, при попытке повторить нужные действия будет вести себя так, как будто оно не помнит, что надо делать, т. е. страдает амнезией. Таковы были представления о биохимических исследованиях памяти в начале шестидесятых годов. К счастью, тогда имелись уже простые методы для определения скорости белкового синтеза и его ингибирования (подавления). Белки образуются путем соединения в длинные цепи отдельных составляющих элементов - аминокислот, которые либо синтезируются самим организмом, либо поступают с пищей. Поэтому, измеряя скорость включения аминокислот в белки, можно судить о скорости образования последних. Если меченную радиоактивным изотопом аминокислоту (как в эксперименте I, описанием в главе 2) давать животному с кормом или вводить путем инъекции, она будет включаться в состав белков вместе с немечеными аминокислотами, и тогда образующиеся белки будут обладать слабой радиоактивностью. Уровень радиоактивности белка пропорционален скорости его синтеза, и это позволяет измерять последнюю простыми и очень чувствительными методами. В состав белков входят двадцать различных природных аминокислот, а каждый индивидуальный белок представляет собой уникальную цепочку из нескольких сотен таких структурных единиц. Точная сборка аминокислот в такого рода цепи осуществляется при посредстве другой гигантской молекулы -- рибонуклеиновой кислоты (РНК), которая в свою очередь синтезируется под прямым контролем генетического материала клетки - дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). (Именно в этом смысле, хотя и не совсем правильно, говорят, что гены «направляют» белковый синтез.) Поэтому для ускоренного образования белка может потребоваться также увеличение синтеза РНК, который можно измерить аналогичным способом, используя радиоактивный предшественник РНК.

Что касается ингибирования белкового синтеза, то почти случайно была обнаружена способность многих антибиотиков, как известно, подавляющих рост и размножение бактерий, блокировать образование микробных белков и РНК. Введение достаточных доз таких антибиотиков в мозг вызывает почти полное прекращение синтеза в нем РНК или белка на протяжении нескольких часов. Это делает принципиально возможными эксперименты двух типов. При так называемом корреляционном подходе животному вводят радиоактивный предшественник белка или РНК, а затем проводят обучение и выясняют, изменилось ли количество радиоактивного белка или РНК по сравнению с их содержанием у контрольных, необученных животных. При другом, интервентивном подходе вводят антибиотик, ингибирующий биосинтез белка или РНК, обучают животное, а потом выясняют, помнит ли оно то, чему был обучено.

В начале шестидесятых годов проводились эксперименты того и другого типа. Я уже рассказывал, какое ошеломляющее впечатление на меня, только что защитившего диссертацию, произвели опыты Хидена, в которых он регистрировал усиление биосинтеза белка и РНК в небольших участках мозга крыс, обученных балансировать на проволоке, по которой они могли добраться до корма. В последующем Хиден несколько изменил условия эксперимента. Заметив, что отдельные крысы предпочитали доставать корм либо правой, либо левой лапой, он вынуждал животных пользоваться для этой цели «неудобной» лапой, а затем оценивал изменения синтеза РНК и белка в той половине и той области мозга, где осуществлялась моторная координация «обучаемой» лапы, в сравнении с теми же процессами в области, ответственной за действия «необученной» лапы [2].

Примерно в то же время, в 1963 году, Уэсли Дингман и Майкл Спорн провели в Рочестерском университете (штат Нью-Йорк) первые опыты с использованием ингибиторов [3]. Они обучали крыс плавать в заполненном водой лабиринте и вводили им ингибитор синтеза РНК. Сначала они установили, что ингибитор не влиял на способность крыс плавать вообще и не заставлял их ошибаться, если ко времени инъекции они уже умели находить верный путь. Но если ингибитор вводили с таким расчетом, чтобы синтез РНК уже прекращался во время обучения, то при последующем испытании крысы не помнили правильной дороги. За этим экспериментом быстро последовали другие, где применялись ингибиторы белкового синтеза, и все они, по сути, приводили к тому же выводу: при подавлении синтеза белка во время обучения животных или в первые часы после его завершения крысы могли освоить задачу, но в случае более позднего тестирования (скажем, на следующий день) они вели себя так, как будто совсем не обучались. По-видимому, для долговременного запоминания необходим синтез белка [4].

Сам я на первых порах с недоверием отнесся к этим результатам. Интенсивность белкового синтеза в мозгу выше, чем в любом другом органе. Антибиотики вводились в мозг в таких больших дозах, что могли полностью блокировать образование белка на несколько часов, однако ни один из других аспектов поведения подопытных животных, по-видимому, не изменялся: ни способность выполнять ранее освоенные задачи, ни способность видеть окружающий мир и реагировать на него, ни какие-либо иные «нормальные» действия. Единственное, чего не могли делать животные, - это запоминать что-то новое. Но ведь не весь белковый синтез в организме в отсутствие ингибитора обслуживает функцию памяти; казалось бы, его блокада должна была сказаться и на других фундаментальных аспектах поведения! Но этого не случалось: появлялись статья за статьей с описанием самых разнообразных тестов, которые предлагались таким разным животным, как крысы и рыбы, и все они приводили к одному и тому же выводу. Чтобы убедиться в его справедливости, мне в конце концов пришлось прибегнуть к последнему средству, испытанному еще Фомой Неверующим: я сам стал обучать цыплят в условиях введения им ингибиторов и получил тот же результат. Значит, все было правильно!

Существует методическая проблема, о которой здесь стоит поговорить: это проблема воспроизведения (или невозможности воспроизведения) данных, полученных другими исследователями, так как именно в этом состоит «научный метод», по крайней мере если верить стандартным учебным пособиям по методологии науки. Экспериментатор сообщает о полученных им результатах, и для их проверки другие исследователи повторяют тот же опыт в своих лабораториях. Если результаты совпадают, их можно предварительно счесть верными. Если же они расходятся, необходимо решить, кто допустил ошибку в постановке эксперимента или в его интерпретации. Это и имеют в виду, когда говорят, что научное знание - это «публичное» достояние, т. е. в принципе оно доступно для проверки и может быть подтверждено или опровергнуто кем угодно, а не является просто личным убеждением¹[5]. Однако даже в так называемой «фундаментальной» или «чистой» науке лишь в редких случаях предпринимаются попытки прямой проверки публикуемых экспериментальных данных (за исключением, может быть, некоторых областей физики). Простое повторение опытов, проведенных другими, - занятие отнюдь не престижное, для такой работы очень трудно получить средства, а ведущие научные журналы редко публикуют «повторные» эксперименты, если речь не идет о каком-нибудь особо дискуссионном вопросе; их не интересуют даже факты неподтверждения результатов, поэтому сообщения об экспериментах с отрицательными результатами появляются не часто².

*1) На практике, однако, дело обстоит гораздо сложнее. Воспроизведение полученных другими данных требует специальных условий и лабораторного оборудования; это дорого и не всем доступно [6]. Возможности проверки такого мнимо «публичного» знания явно ограниченны, с чем пришлось столкнуться не одной группе активистов охраны окружающей среды при попытке оспорить заключения экспертов о безопасности того или иного мероприятия.

*2) Фурор, произведенный в конце 80-х и начале 90-х годов утверждениями Понса и Флейшмана относительно холодного ядерного синтеза и результатами Бенвениста, якобы подтверждающими ценность гомеопатии, - один из немногих случаев (помимо экспериментов по «передаче навыков», см. ниже), когда были предприняты (и оказались неудачными) попытки прямого воспроизведения данных.

Если результаты, полученные одним исследователем, вызывают интерес у другого, последний обычно старается повторить эксперимент в ином варианте, т. е. воспроизвести его на своем излюбленном объекте или в более близкой ему экспериментальной ситуации. Именно так поступил я: вместо того чтобы проверять чужие данные на крысах и мышах, которых использовали мои предшественники, я решил посмотреть, что произойдет, если я подвергну такому же испытанию своих цыплят. Этот непрямой способ воспроизведения хорош тем, что сходные результаты, полученные на разных видах животных, имеют самостоятельную ценность и могут быть опубликованы. Это в равной мере относится и к отличающимся результатам, при публикации которых совершенно не обязательно сталкивать их в лоб с ранее полученными данными. Учитывая большое разнообразие явлений биологического мира, расхождения между результатами обычно приписывают использованию разных животных (например, «межвидовым или межлинейным различиям») или особенностям экспериментальных условий и не придают им особого значения. Поэтому, не встречая опровержения, противоречивые или сомнительные результаты остаются «в литературе»: их никто прямо не отрицает, но в целом они игнорируются. Посвященные, т. е. узкая группа специалистов в той или иной области, которые проводят много времени на конференциях и семинарах, обсуждая положение дел в своей науке, либо совсем не говорят об аномальных результатах, либо сплетничают по их поводу в баре после заседания. Первым сообщениям об амнестическом эффекте ингибиторов белкового синтеза не придавали значения - чаще всего по тем же самым априорным соображениям, которые были причиной моего собственного скепсиса; не без борьбы они в конце концов добились признания у этих законодателей моды.

Лишь спустя много лет после публикации результатов первых опытов с ингибиторами мне самому пришлось вплотную заняться изучением их действия. В то время меня интересовали совсем другие вопросы, и я думал, что работа с ингибиторами будет отвлекать меня. Когда я, наконец, приступил к ней в конце 80-х годов (об этом речь пойдет в главе 10), я имел в виду более специальную цель, поскольку уже к концу 60-х - началу 70-х годов широко развернулись наши исследования по импринтингу. Общий план экспериментов состоял в том, что у однодневных цыплят создавали импринтинг, вводили им радиоактивные предшественники РНК или белка и измеряли включение их в РНК и белок в различных областях мозга. Если это перечисление операций кажется вам чересчур сухим и абстрактным, я опишу их несколько подробнее.

Прежде всего, каким образом я вызываю импринтинг? В естественных условиях цыплята очень скоро (не позднее трех дней после вылупления) начинают узнавать мать и повсюду следовать за ней. Но их понятие о «матери» вначале довольно расплывчато. Сразу после вылупления они пробуют приблизиться и следовать за первым же увиденным медленно движущимся предметом, который размерами и цветом более или менее напоминает курицу. Исследователи импринтинга использовали для этой цели чучело или даже просто красный шар на вращающейся рукоятке. Пэт Бейтсон разработал стандартную процедуру обучения. Цыплят помещают во вращающееся на оси колесо вроде того, какое обычно покупают для клетки с хомяками. Колесо ставят перед вращающимся устройством, дающим проблески красного или желтого света. Проблески создают впечатление движущегося света, и помещенные в колесо цыплята пытаются следовать за ними. Спустя примерно час свет выключают, чтобы цыплята немного, отдохнули, после чего проводят тестирование, давая птенцам возможность выбирать между светом, на который у них выработался импринтинг (скажем, красным) и другим, незнакомым (желтым). Разницу в частоте следования за красным и за желтым светом считают показателем силы импринтинга.

В определенное время после начала светового воздействия цыплятам вводили радиоактивный предшественник, затем продолжали тренировку и проводили испытание, после чего животных забивали. Поскольку мы не знали, в какой части мозга могут возникнуть изменения, и не очень разбирались в его анатомии (в то время мало кто знал анатомию куриного мозга), мы произвольно делили передний мозг на две части, называя их просто «крышей» и «основанием». Впоследствии, по мере того как мы получали все более точные данные о локализации изменений, подразделение мозга становилось более детальным и анатомически более осмысленным. Пэт и Габриел Хорн кодировали образцы мозговой ткани и посылали их мне для анализа. После первых же экспериментов стало ясно, что в сравнении с «контрольными» птицами, которые находились в темноте или подвергались воздействию рассеянного верхнего света, у цыплят с импринтингом на проблески в часы после тренировки усиливался биосинтез РНК в крыше мозга. Повторив опыт с предшественником белков, мы нашли, что и синтез белка усиливается. Я продолжил более детальные биохимические исследования с двумя моими первым диссертантами.

Однако в то время Пэта, Габриела и меня интересовали не столько биохимические подробности, сколько вопрос об интерпретации результатов. Хотя мы и установили, что стимуляция цыплят сопровождается усилением биосинтеза РНК и белков, но как показать, что оно было результатом именно обучения? Может быть, биосинтез усиливался просто потому, что цыплятам приходилось больше двигаться в колесе, чем их собратьям, содержавшимся в темноте или при слабом освещении? Или вспышки света просто возбуждали их или же как-то влияли на зрительную систему? Каждый из этих факторов мог быть причиной наблюдавшегося усиления синтеза РНК и белка. Не так легко придумать эксперименты для проверки этих альтернативных возможностей, и в начале 70-х годов нам понадобилось несколько лет, чтобы одну за другой опровергнуть их. К 1973 году нам, наконец, удалось убедить самих себя и, я надеюсь, всех других интересующихся этой проблемой, что биохимические изменения были в самом деле результатом обучения, а не сопутствовавших обстоятельств, таких, как моторная активность или зрительные впечатления. Например, в одном из ключевых экспериментов мы обучали более сотни цыплят, определяя показатель импринтинга, двигательную активность (т. е. характер поведения в колесе) и синтез РНК. Последний не зависел от моторной активности или от стресса (насколько о нем можно было судить, например, по частоте различных звуков, издаваемых цыплятами), но достоверно коррелировал с проявлениями импринтинга. Иными словами, чем лучше птенцы научались различать световые сигналы и адекватно реагировать на них, тем больше РНК синтезировалось в крыше переднего мозга [7].

Таким образом, наши работы и данные других лабораторий, полученные примерно в то же время, показали, что для образования следов памяти необходим синтез РНК и белка. Казалось, можно было ожидать быстрых успехов в области биохимии памяти. К сожалению, этого не случилось. Вместо того мы получили мешанину из случайных биохимических данных и противоречивых методических соображений, что задержало прогресс в изучении памяти более чем на десятилетие. Поскольку ошибки всегда поучительны, стоит затратить немного времени и разобраться в том, что произошло.