ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Как уже упоминалось, в ДНК содержится определенная генетиче­ская информация:

-о структуре всех белков и РНК организма,

- а также о порядке реализации этой информации в раз­ных клетках в процессе онтогенеза и при различных функциональных состояниях.

Поскольку во всех соматических клетках организма содержится один и тот же набор хромосом, характерный для данного вида - то, несмотря на подчас сильные отличия между клетками, все они содержат в своих ДНК одну и ту же генетическую информацию. Некоторое ис­ключение составляют лимфоциты, в процессе формирования которых происходит перестройка генов иммуноглобулинов.

Как уже упоминалось в процессе репликации ДНК генетиче­ская информация воспроизводится целиком, чтобы затем пере­даваться дочерним клеткам.

Но, кроме того, эта информация экспрессируется (реализу­ется) в клетке, обуславливая все проявления ее жизнедеятель­ности. Однако экспрессии подвергается отнюдь не вся имеющая­ся в ядре генетическая информация, а лишь какая-то (обычно весьма небольшая) ее часть.

Этим и обусловлены особенности тех или иных клеток — тем, каков спектр (набор) функционирующих генов и каковы при этом уровни их активности.

Экспрессия информации о структуре определенного белка включает 2 основных этапа.

Первый из них — транскрипция: образование в клеточ­ном ядре на соответствующем гене (локализующемся в одной из хромосом) специального посредника — матричной РНК (мРНК). Смысл этого процесса — переписывание информации о структуре белка с огромного неподвижного носителя (ДНК в составе хромосомы) на небольшой подвижный носитель —мРНК.

И лишь после того зрелая мРНК в комплексе со специальными белками поступает из ядра в цитоплазму.

Второй из основных этапов экспрессии гена — трансля­ция: синтез белка на рибосомах по программе, диктуемой мРНК. Суть этой программы — определение очередности, в ко­торой аминокислоты должны включаться в строящуюся пеп­тидную цепь.

Функциональные отделы генома. Гены и их структура

Собственно информация о структуре белков и РНК записа­на в участках ДНК, называемых генами и цистронами.

Ген — это участок ДНК, кодирующий один белок.

Цистрон — участок ДНК, кодирующий одну полипеп­тидную цепь.

Таким образом, если белок состоит из нескольких разных полипептидных цепей (субъединиц), то его ген включает не­сколько цистронов (рис. 5.1).

Однако такое подразде­ление относится, в основном, к бактериям, где цистроны одного гена обычно следуют на ДНК друг за другом.

У животных и чело­века цистроны нередко рас­полагаются в разных хромо­сомах и обычно тоже называ­ются генами: например, ген a-цепи и ген b-цепи гемогло­бина.

Кроме генов всех белков организма, в хромосомах имеются также гены РНК — четырех видов рибосомных РНК и нескольких десятков транспортных РНК.

Общая совокупность генов, определяющих наследственную информацию организма, называется геномом.

Всего в геноме бактерий (конкретно — кишечной палоч­ки) - около 2500 цистронов. В хромосомах человека число ге­нов, по последним данным, составляет около 30 000.

Почти все гены эукариот (в отличие от генов прокариот) имеют характерную особенность: содержат не только кодирую­щие участки - экзоны, но и некодирующие - интроны (рис. 5.2).

Рис.5.2. Экзоны и интроны в гене

Экзоны и интроны перемежаются друг с другом, что придает гену как бы «разорванную» структуру. Число интронов в гене варьирует от 2 до несколь­ких десятков; в гене миози­на их около 50. Порой на ин­троны приходится до 90 % общей длины гена.

Возможно, такая орга­низация генов объясняется тем, что в эволюции они образовались из разных фрагментов ДНК (соответствующих теперешним экзонам), которые соединились, хотя и не полностью, в единые функциональные элементы.

Прочие отделы ДНК. Между генами также находятся некодирующие последова­тельности - спейсеры. Несмотря на общее название, функцио­нальная роль их может быть абсолютно различной.

а) Многие спейсерные участки, видимо, выполняют струк­турную роль:

· участвуют в правильной укладке нуклеосомной цепи
в высшие структуры хроматина,

· в прикреплении хромосом к аппарату центриолей и т. д.

б) Другие некодирующие участки ДНК служат специфиче­скими локусами связывания определенных белков:

· функционирующих на ДНК ферментов (ДНК-полиме-
разного комплекса и др.),

· белков, выполняющих регуляторную функцию.

При этом участки связывания РНК-полимеразы (фермен­та, синтезирующего РНК на ДНК) называются промоторами. Они либо вплотную примыкают к началу гена (или группы ге­нов), либо отделены от гена какими-либо другими функцио­нальными локусами.

Характерный компонент промоторов у кишечной палоч­ки — т. н. бокс (последовательность) Прибнова:

в) Что касается участков связывания регуляторных бел­ков, то у бактерий их называют операторами. Они располагают­ся после промотора (рис. 5.3). При определенных условиях с оператором связывается специфический белок-репрессор, и это блокирует «прочтение» РНК-полимеразой соответствую­щей группы генов. У эукариот регуляцию «прочтения» ге­нов осуществляют не только белки-репрессоры, но и белки-ак­тиваторы — т. н. транскрипционные факторы (рис. 5.3).

Рис. 5.3. Функциональные отделы в ДНК бактерий

К последним относятся уже упоминавшиеся общие факторы транскрипции, необходимые для связывания РНК-полимеразы с промотором. Эти факторы имеются во всех клетках и необходи­мы для «прочтения» любого функционирующего гена. Другие транскрипционные факторы повышают активность только определенных генов, и локусы ДНК, связывающие такие факторы, называются энхансерами. Энхансеры могут располагаться достаточно далеко от регу­лируемого гена: на расстоянии нескольких тысяч нуклеотидных пар. Как же связывание с ними транскрипционных факто­ров может стимулировать активность гена?

Видимо, дело в сложной пространственной организации ДНК. Последняя образует петли, благодаря чему энхансеры сближаются с промоторной зоной и связанные с ними факторы влияют на активность транскрипционного комплекса (рис.5.4.).

Рис.5.4. Функциональные отделы в ДНК эукариот

Причем, для некоторых ключевых генов в клетке имеется сразу несколько энхансеров, достаточно удаленных друг от дру­га. Следовательно, все они в результате изгибов ДНК должны со­бираться примерно в одном месте пространства.

Что же касается белков-репрессоров, то они при вхожде­нии в состав транскрипционных комплексов не повышают, а по­нижают их активность.

Часто используется также термин «супрессоры» — так называются факторы (обычно это белки), которые угнетают тот или иной клеточный процесс. Например, опухолевые супрес­соры — регуляторные белки, препятствующие опухолевому рос­ту. Очевидно, по механизму своего действия они могут быть как репрессорами, так и транскрипционными факторами.

г) В ДНК могут содержаться короткие локусы, служащие сигналами об окончании (терминации) транскрип­ции ДНК.

У бактерий в ряде случаев участки с такой функцией нахо­дятся перед группой совместно регулируемых генов. Это т. н. ат­тенюаторы (см. рис. 5.3). Терминирующие же участки, распола­гающиеся после генов, называются терминаторами.

В одних условиях транскрипция прекращается на аттенюа­торе (гены не считываются), в других условиях — на терминато­ре (гены прочитываются).

У эукариот сигналы терминации более сложные: в отличие от бактериальных, они тоже транскрибируются РНК-полимеразой, и только затем последняя завершает свою работу.

Оперонная организация генетического материала у бактерий. Регулируемые и конститутивные гены

Общая схема оперона

У бактерий гены ферментов, катализирующих ряд после­довательных реакций, нередко объединяются в одну структур­но-функциональную единицу — оперон (рис. 5.5).

Рис.5.5. Схема функционирования оперона

Помимо указанных генов, в оперон входят промотор (место связывания РНК-полимеразы) и оператор (место свя­зывания белка-репрессора).

Сам же белок-репрессор кодируется специальным геном-регулятором, который в состав оперона обычно не входит. Для разных оперонов существуют разные белки-репрессоры и, соответственно, разные гены-регуляторы. Хотя не исключено, что какие-то белки-репрессоры контролируют активность сразу нескольких оперонов.

Принцип регуляции активности оперона состоит в том, что на сродство белка-репрессора к оператору могут влиять метабо­литы той цепи реакций, ферменты которой кодируются данным опероном. В связи с этим различают опероны двух типов.

а) Индуцибельные опероны:

- регулятором является исходный субстрат (S_o) цепи кон­тролируемых реакций;

- в отсутствие этого субстрата белок-репрессор имеет высо­кое сродство к оператору, отчего РНК-полимераза не мо­жет транскрибировать гены оперона (оперон «выклю­чен»);

- при накоплении метаболита S_o в клетке некоторое коли­чество его связывается с белком-репрессором, понижая сродство последнего к оператору; оперон «включается» - и синтезируются ферменты, обеспечивающие превраще­ния вещества S_o.

Как видно, регуляция оперона веществом S_o — это пример прямой положительной связи: начальный субстрат стимулиру­ет в конечном счете реакции своего метаболизма.

б) Репрессибельные опероны:

- регулятором служит конечный продукт (Р_n) цепи контро­лируемых реакций;

- в отсутствие этого продукта белок-репрессор имеет низкое
сродство к оператору; поэтому РНК-полимераза транскри­бирует гены оперона — оперон «включен», и синтезируют­ся ферменты, способствующие образованию вещества Р_n;

- при накоплении же данного вещества некоторое его коли­чество связывается с белком-репрессором и повышает сродство последнего к оператору - оперон «выключает­ся», синтез соответствующих ферментов и образование метаболита Р_n прекращаются.

Здесь, в отличие от предыдущего случая, мы видим регуля­цию по типу отрицательной обратной связи: метаболит тормо­зит в итоге реакции, ведущие к его образованию.

Таковы общие схемы функционирования индуцибельных и репрессибельных оперонов. Но организация конкретных оперонов нередко включает те или иные дополнительные детали, которые порой существенно усложняют картину.

Конститутивные гены и белки. Подоб­ным образом регулируется активность далеко не всех генов.

Многие гены являются конститутивными, т. е. все время находятся в активном состоянии, и скорость их транскрипции не подвергается избирательной регуляции (хотя и может ме­няться в связи с изменением общего состояния клетки). Такие гены кодируют белки (в т. ч. ферменты), постоянно необходи­мые клетке.

Эти белки (как и гены) тоже называются конститутивны­ми. Для кишечной палочки к подобным белкам относятся, на­пример, ферменты метаболизма глюкозы.

Но скорость транскрипции различных конститутивных ге­нов может не совпадать. Этому может быть несколько причин.

а) Одна из них — различное сродство промоторов к РНК-полиме-разе, или, как говорят, различная «сила» про­моторов.

У некоторых конститутивных генов промотор имеет высо­кое сродство к РНК-полимеразе (т. е. является «сильным»). По­этому здесь молекулы РНК-полимеразы связываются с промото­ром часто, отчего за единицу времени образуется большое коли­чество копий мРНК.

У промоторов других генов невысокое сродство к РНК-по­лимеразе. Соответственно, молекулы этого фермента связыва­ются редко, и образуется гораздо меньше копий мРНК.

б) Вторая возможная причина заключается в самой РНК-полимеразе.

В разных условиях существования бактериальной клетки образуются сигма-факторы, узнающие разные промоторы. Так, особые сигма-факторы соответствуют обычным условиям, азот­ному голоданию, тепловому шоку и состоянию споруляции. В каждом из этих случаев РНК-полимераза связывается с про­моторами одних генов и не связывается с промоторами других генов.

Таким образом, у бактерий используются два принципи­альных способа регуляции экспрессии генов:

- регуляция связывания РНК-полимеразы с промоторами (за счет природы промотора, природы сигма-фактора РНК-полимеразы, а также, как мы увидим на примере лактозного оперона, специального белка САР);

- регуляция перемещения связавшейся РНК-полимеразы от промотора к собственно генам (при «чисто» опероном механизме регуляции).

Примеры оперонов. Лактозный оперон — пример индуцибельных оперонов. Лактозный оперон интересен тем, что здесь в одной регуляторной системе используются сразу оба только что названных принципиальных подхода — регуляция и связывания РНК-по­лимеразы, и ее перемещения через оператор.

Причем, существуют и другие опероны со сходным прин­ципом организации. Примечательно, что все они являются индуцибельными и все контролируют распад (катаболизм) посту­пающих извне питательных веществ. В то же время не для всех таких веществ имеется оперонный принцип регуляции, приме­ром чему, как отмечалось выше, служит глюкоза.

Рассмортим лактозный оперон (рис. 5.6).

Рис.5.6. Схема лактозного оперона

Пр- промотор, О – оператор, С- САР (белковый активатор катаболизма), Е- РНК-полимераза, R_л – репрессор лактозного оперона, Е₁- b-галактозидаза, Е₂- пермеаза, Е₃- трансацетилаза, АЦ- аденилатциклаза

Он вклю­чает три гена. Из них первые два кодируют ферменты утилиза­ции лактозы: пермеазу и b-галактозидазу.

Пермеаза необходима для проникновения лактозы из вне­шней среды в клетку. Заметим, что даже при «выключенном» опероне имеется небольшое количество пермеазы. Поэтому при появлении во внешней среде лактозы какое-то количество ее мо­жет проникать внутрь и оказывать сигнальное воздействие на лактозный оперон.

Второй фермент — b-галактозидаза — катализирует распад лактозы на глюкозу и галактозу. Последние далее вступают в катаболические превращения, обеспечиваемые конститутивными фер­ментами. При «выключенном» опероне имеется небольшая актив­ность и этого фермента. Это важно потому, что параллельно с основ­ной реакцией (гидролизом лактозы) происходит и побочная — изо­меризация лактозы в аллолактозу (где галактоза и глюкоза соеди­нены не 1,4-, а 1,6-гликозидной связью). И именно аллолактоза, а не лактоза, служит регулятором активности оперона.

Конкретно, аллолактоза, появляясь в клетке при наличии во внешней среде лактозы, связывается с лактозным репрессором. Этот белок кодируется специальным геном, имеет 4 субъе­диницы и в отсутствие аллолактозы связывается с оператором лактозного оперона, блокируя транскрипцию генов оперона. Аллолактоза же, связываясь с репрессором, снижает его срод­ство к оператору, что деблокирует гены. Таким образом, при по­явлении вне клетки лактозы происходит активация лактозного оперона и интенсивное образование в клетке ферментов утили­зации лактозы.

Но это имеет место только тогда, когда во внешней среде нет глюкозы. Если же там достаточно глюкозы, то биологического смысла в использовании лактозы уже нет. В соответствии с этим, глюкоза препятствует активации лактозного оперона даже в присутствии больших количеств лактозы.

Достигается это путем влияния на связывание РНК-полимеразы с промотором. Дело в том, что промоторная область в лактозном опероне (и в сходных с ним оперонах) шире, чем обычно, и способна связывать не только РНК-полимеразу, но и особый белок — CAP (catabolite gene activator protein), бел­ковый активатор катаболизма.

В отсутствие САР РНК-полимераза очень плохо связывает­ся с промотором лактозного оперона, а САР изменяет структуру промотора, резко повышая его сродство к РНК-полимеразе. По существу, САР играет у бактерий примерно ту же роль, что общие факторы транскрипции у эукариот. Только САР необходим для деятельности лишь некоторых оперонов, тогда как общие факторы транскрипции — для функционирова­ния любого гена эукариот.

Связывание САР с промотором происходит, только если САР находится в комплексе с циклическим АМФ (цАМФ). По­следний же образуется из АТФ под влиянием фермента адени-латциклазы.

В отсутствие глюкозы активность аденилатциклазы высо­кая, в клетке — достаточная концентрация цАМФ, поэтому САР связан с лактозным промотором, к которому легко присое­диняется РНК-полимераза. В этих условиях активность оперона зависит только от того, свободен или нет оператор, т. е. от нали­чия во внешней среде лактозы.

Если же имеется глюкоза, то активность аденилатциклазы оказывается сниженной, отчего в итоге промотор остается без САР и практически теряет сродство к РНК-полимеразе. Лактозный оперон не функционирует, а в качестве питательного суб­страта используется глюкоза.

Третий ген оперона кодиру­ет трансацетилазу — фермент, катализирующий in vitro ацетилирование тиогалактозида. Имеет ли трансацетилаза какое-ли­бо отношение к обмену лактозы и почему ее ген находится в лак­тозном опероне, неясно.

Триптофановый оперон — пример репрессибельных оперонов. В триптофановом опероне, как и в лактозном, тоже имеется двойной механизм регуляции. Во-первых, как обычно, регули­руется перемещение РНК-полимеразы по оператору. Вторым же (и более чувствительным) объектом регуляции является не свя­зывание РНК-полимеразы с промотором, а окончание тран­скрипции на аттенюаторе.

Как правило, опероны, имеющие аттенюатор, являются ре-прессибельными и контролируют синтез (анаболизм) того или иного необходимого компонента — например, редкой аминоки­слоты: триптофана, гистидина, фенилаланина.

Триптофановый оперон (рис. 5.7) включает 5 цистронов, кодирующих четыре фермента заключительного этапа образо­вания триптофана.

Рис.5.7. Схема триптофанового оперона

Пр-промотор, О- оператор, Л- лидерный отдел оперона, Ат- аттенюатор, R- белок-репрессор, Е- РНК-полимераза, ЛП- лидерный пептид, Е₁…Е₅ - ферменты синтеза триптофана, Р₁…Р₄- промежуточные метаболиты пути синтеза триптофана.

При этом последний фермент содержит субъединицы двух видов, отчего кодируется двумя цистронами. Вместе с тем, ген предпоследнего фермента цепочки, по-видимо­му, находится где-то вне данного оперона.

Вслед за промотором и оператором в оперонах этого типа находится т. н. лидерный отдел; именно он оканчивается атте­нюатором.

В процессе транскрипции этого отдела образуется лидер­ный участок мРНК. Последний тут же связывает рибосому и на­чинает трансляцию с образованием лидерного пептида (ЛП). Ключевая особенность последнего — среди его 14 аминокислот­ных остатков содержатся 2 остатка триптофана, т. е. той самой аминокислоты, синтез которой контролируется опероном.

Аналогично, в ЛП фенил ал анинового оперона среди 15 ос­татков — 7 остатков фенилаланина, а в ЛП гистидинового опе­рона — 7 подряд остатков гистидина. Так что механизм аттенюаторной регуляции во всех этих случаях одинаков.

Когда в клетке доста­точно триптофана, то синтез лидерного пептида идет без за­держки: образующая его рибосома не отстает от РНК-полимера­зы. В этих условиях при достижении РНК-полимеразой атте­нюатора с высокой долей вероятности срабатывает сигнал об окончании транскрипции: РНК-полимераза диссоциирует от ДНК и гены не считываются.

Таким образом, триптофан, быстро включаясь в лидерный пептид, блокирует через аттенюаторный механизм синтез фер­ментов, необходимых для его образования. Правда, блокирова­ние это — не полное, т. к. сохраняется небольшая вероятность того, что РНК-полимераза все же преодолеет аттенюаторный участок.

Если, наоборот, концентрация триптофана в клетке низ­кая, то рибосома задерживается с синтезом лидерного пептида и отстает от РНК-полимеразы. Это так меняет конфигурацию ДНК или лидерного отдела мРНК, что сигнал об окончании трансляции на аттенюаторе не срабатывает. Каждая молекула РНК-полимеразы проходит этот «опасный» участок и транскри­бирует гены. Т.е. активно синтезируются ферменты, необходи­мые для пополнения запаса триптофана в клетке.

Содержание триптофана в самих этих ферментах весьма невелико. Поэтому его дефицит в клетке не очень сильно сказывается на скорости трансляции структурных цистронов мРНК (в отличие от синтеза лидерного пептида).

Итак, через аттенюаторный механизм триптофан может по­давлять активность «своего» оперона, но, как было сказано, не до конца.

Более глубокое подавление активности оперона происходит при очень высокой концентрации триптофана. Тогда реализует­ся второй (и более общий) способ регуляции. Триптофан связы­вается со специфическим белком-репрессором и повышает его сродство к оператору триптофанового оперона. Это полностью блокирует данный оперон.