ПРОЦЕСС ТРАНСКРИПЦИИ У ПРО- И ЭУКАРИОТ

Общая характеристика транскрипции. В отличие от репликации ДНК, тесно связанной с клеточ­ным делением, транскрипция ДНК происходит прак­тически во всех ядросодержащих клетках — как делящихся, так и неделящихся.

Причем в делящихся клетках она совершается в любой мо­мент митотического цикла, кроме периода репликации (у эукариот) и собственно деления. У прокариот, видимо, нет и этого ограничения: клеточный цикл бывает столь коротким (20-40 мин), что репликация и транскрипция происходят одно­временно, только на разных участках молекулы ДНК (которая у бактерий является кольцевой).

Более того, транскрипция какого-либо участка ДНК может совершаться не только почти в любой момент цикла, но и много­кратно — сколь угодное число раз. С другой стороны, набор транскрибируемых в клетке участков под действием тех или иных факторов нередко меняется.

Ферментативное обеспечение процесса осуществляется РНК-полимеразой. Фермент ползет вдоль ДНК и катализирует поочередное включение в растущую цепь рибонуклеотидов, комплементар­ных нуклеотидам матричной цепи ДНК.

Субстратами синтеза РНК являются рибонуклеозидтрифосфаты (рНТФ); как и при синтезе ДНК, в ходе включения в строящуюся цепь они теряют пирофосфатные ос­татки:

Свободные остатки рНМФ + пиро

рНТФ в строящейся цепи РНК фосфат

Это обеспечивает процесс энергией, так что дополнитель­ных ее источников не требуется.

Еще одно сходство с синтезом ДНК состоит в направлении роста строящейся цепи — 5'→3'. Это значит, что у этой цепи оче­редные нуклеотиды присоединяются к 3'-концу.

Как при всех матричных синтезах, строящаяся цепь антипа­раллельна матричной цепи ДНК. Следовательно, по­следняя транскрибируется ферментом в направлении 3'→5'.

Но имеются и принципиальные отличия от синтеза ДНК.

а) Асимметричность процесса: в качестве матрицы, как мы знаем, используется лишь одна цепь ДНК. Не совсем ясно, как ферментная система осуществляет правильный выбор нужной це­пи. Видимо, ключевую роль тут играют какие-то последователь­ности нуклеотидов на одной из цепей, узнаваемые системой.

б) Консервативность процесса: молекула ДНК по оконча­нии синтеза РНК возвращается в исходное состояние. При син­тезе же ДНК молекулы наполовину обновляются, что делает ре­пликацию полуконсервативной.

в) Беззатравность процесса: синтез РНК не требует для своего начала ника­кой затравки, тогда как при репликации ДНК необходима РНК-затравка.

Процесс транскрипции у прокариот и эукариот существенно различается.

Основные этапы транскрипции:

1. Инициация

2. Элонгация

3. Терминация

4. Процессинг

Особенности транскрипции у прокариот. Осуществляется ДНК-зависимой РНК полимеразой - ферментом катализирующим синтез РНК, который состоит из нескольких субъединиц: двух a, одной b, одной b^’ и одной s. Такой комплекс (2abb^’s) называется холо-ферментом и имеет молекулярную массу около 500 000 Да. Фермент лишенный s-субъединицы называется кор-ферментом (рис.4.7).

Две a субъединицы представляют собой каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы. b^’- субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот. В b- субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в холо-, а другой - в кор- ферменте.

Только холо-фермент обладает высоким сродством к специфической последовательности нуклеотидов - промотору, сродство к остальным случайным последовательностям ДНК у него снижено в 10000 раз. У кор-фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.

Сам по себе s- фактор обладает наименьшим сродством к ДНК по сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает холо-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным сродством к промотору.

1. Инициация.

Для инициации транскрипции необходим холофермент, нуклеозидтрифорфат ( всегда АТФ или ГТФ) и наличие специального участка в ДНК называемого промотором.

Рис. 4.7. Процесс транскрипции у прокариот

Промотор – это участок молекулы ДНК имеющий размер около 40 пар оснований и расположенный непосредственно перед участком инициации транскрипции. Изучение нуклеотидной последовательности более чем 50 разных промоторных участков ДНК прокариот выявило только два консервативных участка, по-видимому играющих ключевую роль в узнавании и функционировании промотора. Одна из этих последовательностей состоит из шести или семи пар оснований и расположена на расстоянии примерно 10-15 оснований до того нуклеотида, с которого начинается транскрипция (+1). Этот участок обычно обозначают как –10-последовательность, или бокс Прибнова в честь ее открывателя и имеет общий вид ТАТ(Рu)АТ(Рu), где Pu- пурин. Вторая последовательность, длина которой обычно равна девяти нуклеотидам, расположена на расстоянии приблизительно 35 оснований до сайта инициации

(–35-последовательность) и также встречается в большинстве промоторов прокариот. Нуклеотидная последовательность сегмента ДНК между –35- и –10- участками не является критической, важно лишь расстояние между этими участками.

–35-последовательность участвует в связывании РНК-полимеразы, которое предшествует перемещению фермента в бокс Прибнова. Когда полимераза связывается с проморотом, происходит локальное расплетение двойной спирали ДНК на протяжении примерно 1,5 витка (15 нуклеотидных пар) и образуется «открытый промоторный комплекс». Первым в строящуюся цепь РНК всегда включается пуриновый нуклеотид – АТФ или ГТФ, причем все три его фосфатных остатка сохраняются. Затем образуется первая 5^’,3^’-фосфатная связь со вторым нуклеотидом.

2. Элонгация цепи РНК – это стадия транскрипции, которая наступает после присоединения примерно 8 рибонуклеотидов. В этот момент РНК-полимераза претерпевает структурное изменение при котором от комплекса отделяется s-субъединица и остается кор-фермент, катализирующий дальнейшее удлинение растущей цепи пре-РНК до окончательного размера по мере продвижения РНК-полимеразы по ДНК.

Соответственно, перемещается и «открытый промоторный комплекс», т.е. участок локального расплетения ДНК. Раскрытая ферментом область составляет только несколько пар оснований. На транскрибированной же части ДНК двухцепочечная спи­ральная структура восстанавливается сразу после ухода РНК-полимеразы.

Примерная скорость движения фермента и синтеза РНК — 30-40 нуклеотидов в секунду.

Транскрипция может сопровождаться ошибками спарива­ния, в результате которых в синтезируемую РНК включаются «неправильные» нуклеотиды. В среднем одна такая ошибка приходится на 2 х 10⁴ включенных нуклеотидов. Это существен­но чаще, чем появление нерепарированных ошибок репликации.

Очевидно, меньшая точность транскрипции связана с тем, что ошибки здесь имеют не столь серьезные последствия. Они легко компенсируются благодаря образованию на одном гене множества копий пре-РНК.

Кроме того, вследствие вырожденности генетического кода, не каждая замена нуклеотида меняет смысл кодона мРНК. Можно найти, что в 67 % ошибок, касающихся третьих положений кодонов, смысл последних остается прежним.

3. Терминация (прекращение роста) цепи РНК происходит на специфических участках ДНК, называемых терминаторами. Начало этих участков обычно обогащено ГЦ-парами, а остальная последовательность АТ-парами. Поскольку сила взаимодействия пар Г-Ц довольно велика, локальное расплетение таких участков ДНК происходит трудней. Это замедляет продвижение РНК-полимеразы и может служить для нее сигналом к прекращению транскрипции.

ГЦ-богатый участок ДНК часто представляет собой палиндром.

Палиндромы - последовательности, которые читаются одинаково слева направо и справа налево.

Палиндромы первого порядка имеют одну ось симметрии, второго - две, третьего - три.

Но еще до окончания процесса в конце новосинтезированной РНК тоже успевает появиться ГЦ-богатый участок. Благодаря взаимодействию между своими нуклеотидами, он образует «шпильку». Т. е. взаимодействия с нуклеотидами матричной цепи ДНК заменяются на «внутришпилечные» взаимодействия. Это облегчает отсоединение РНК от ДНК.

У бактерий тому же самому часто способствует и специальный белок —Rho-фактор (ρ-фактор). Он движется по ДНК вслед за РНК-полимеразой, догоняет ее на ГЦ-участке ДНК и, обладая расплетающей активностью, облегчает расхождение цепей РНК и ДНК.

4. Посттранскрипционный процессинг – это процесс созревания при котором первичные пре-РНК модифицируются и превращаются в зрелую РНК. Характер и степень модификации пре-РНК зависит от типа РНК.

У прокариот мРНК не подвергается процессингу. У некоторых бактерий транскрипция и трансляция сопряжены т.е. происходят одновременно: 5^’-конец мРНК может транслироваться на рибосоме и затем подвергаться деградации еще до заверщения синтеза ее 3¢-конца.

Молекулы тРНК вначале синтезируются в виде пре-тРНК, которая примерно на 20% длиннее, чем соответствующая тРНК. Лишние последовательности, расположенные у 5¢ и 3¢-концов удаляются с помощью таких ферментов как рибунуклеазы Q и Р. Иногда молекула пре-тРНК состоит из двух или более молекул тРНК соединенных между собой. Их разделение также осущетвляется также рибонуклеазами.

Гены рРНК прокариот расположены в транскрипционных блоках. Например три гена рРНК кишечной палочки располагаются вместе с генами нескольких тРНК в одном таком блоке и транскрибируются в виде одной молекулы РНК. Эти молекулы рРНК и тРНК отделены друг от друга спейсерной РНК. Расщепление первичного транскрипта на отдельные составляющие катализирует рибонуклеаза Q.

Особенности транскрипции у эукариот. 1. У эукариот для транскрипции используются три ДНК-зависимых РНК-полимераз. РНК-полимераза I локализована в ядрышке, где она катализирует синтез пре-рРНК в виде большого первичного транскрипта содержащего молекулы рРНК 18S 5,8S и 28S. РНК-полимераза II находится в нуклеоплазме и участвует в синтезе первичного транскрипта мРНК. РНК-полимераза III также локализована в нуклеоплазме и участвует в синтезе тРНК и 5S-рРНК (малая рРНК).

2. В случае эукариот промотор – более сложное понятие, поскольку РНК-полимераза связывается с ДНК не непосредственно, а лишь вместе с комплексом других белков – т.н. общих факторов транскрипции.

Наиболее часто (у 80% промоторов эукариот) различают небольшую область инициации, ТАТА-бокс (сходный с боксом Прибнова у бактерий) и ряд других типичных участков – ГЦ-, ЦААТ- и другие боксы. Очередность их расположения в разных промоторах неодинакова: в одних случаях ГЦ-бокс предшествует ТАТА-боксу, а в других – наоборот, следует после него.

3. На этапе инициации транскрипции у эукариот всегда требуется предварительное связывание с промотором целой совокупности белков – общих факторов транскрипции, с образованием комплекса TFIID (Transcriptional Factor D for polymerase II). Из обозначения следует, что эти белки необходимы для связывания с промотором РНК-полимеразы II. Если же ген транскрибируется РНК-полимеразой I или III, его промотор содержит вместо ТАТА-бокса какую- то иную последовательность и используются другие факторы транскрипции.

4. У эукариот более сложными являются и сигналы терминации. В отличие от бактериальных, они тоже транскрибируются РНК-полимеразой, и только затем последняя завершает свою работу.

5. В результате транскрипции у эукариот (в отличие от прокариот) образуются лишь предшественники тех или иных РНК — мРНК, рРНК и тРНК.

В строении зрелых цепей РНК каждого вида и соответствующих пре-РНК существуют следующие различия:

а) Пре-мРНК (рис.4.8). Эти цепи обычно в несколько раз длиннее, чем зрелые мРНК. Они, во-первых, включают транскрипты спейсеров (представляющих собой регуляторные участки, отде­лы со структурной ролью и т. д.). Во-вторых, кодирующая часть пре-мРНК, как и в исходном гене, прерывается интронами. При этом интронные последовательности нередко образуют «шпильки».

Длина пре-мРНК не только гораздо больше, чем у мРНК, но и значительно сильней варьирует у раз­ных молекул — от 2 тыс. до 20 тыс. нуклеотидов. Поэтому дан­ный вид РНК часто называют гетерогенной ядерной РНК (гяРНК).

Другая особенность пре-мРНК — отсутствие на 5'-конце «колпачка» (кэпа), а на 3'-конце — поли(А)-фрагмента.

Рис. 4.8. Продукт транскрипции – пре-мРНК

(«лишние» нуклеотидные последовательности показаны пунктиром)

В большинстве случаев пре-мРНК эукариот несут информацию о синтезе лишь одной пептидной цепи, т. е. дают при созревании только одну молекулу мРНК.

Среди исключений из этого правила — гистоновая пре-мРНК. Кластер гистоновых генов транскрибируется как единое целое, а при созре­вании пре-мРНК из послед­ней «нарезаются» 5 разных гистоновых мРНК.

Наличие подобных ис­ключений — еще одно отли­чие пре-мРНК от мРНК: все зрелые мРНК эукариот, без каких-либо исключений, являются моноцистронными.

б) Пре-рРНК (рис.4.9). Кластер трех генов рРНК тоже транскрибируется как единое целое. Образующаяся пре-рРНК, или 45S-РНК, содержит последовательности сразу трех зрелых рРНК — 18S-, 5,8S- и 28S-рРНК.

Рис. 4.9. Продукт транскрипции – пре-рРНК

(«лишние» нуклеотидные последовательности показаны пунктиром)

Эти последовательности разделены спейсерами, но не со­держат интронов. Кроме того, в них нет модифицированных нуклеотидов, содержащихся в зрелых рРНК.

в) Пре-тРНК (рис.4.10). В отличие от пре-рРНК, все пре-тРНК содержат последовательности лишь одной тРНК.

При этом уже на уровне пре-тРНК образуется типичная структура «клеверного листа». Однако последняя еще отличает­ся от окончательной: в ней

- имеется ряд дополнительных последовательностей (с обеих концов и в середине молекулы),

- отсутствуют минорные нуклеотиды,

- не сформирована типичная последовательность акцеп­торной петли (ЦЦА),

- антикодон не занимает своего «правильного» положения.

Из всего вышесказанного ясно, что непосредственные продукты транскрипции действительно должны подвергаться определенным (и существенным) изменениям для того, чтобы превратиться в функционально активные цепи РНК.

Созревание (процессинг) РНК. Практически все процессы созревания РНК могут быть по­дразделены на три типа:

· удаление одних,

· присоединение других и

· модификация тех же или третьих нуклеотидов.

Удаление «лишних» нуклеотидов осуществляется спе­циальными нуклеазами. Экзонуклеазы последовательно отще­пляют с определенного конца цепи (3' или 5') по одному нуклеотиду. А эндонуклеазы разрезают цепь где-то в средних участ­ках, приводя к ее фрагментации.

Процессы созревания, идущие с участием нуклеаз:

1. Отщепление отдельных «лишних» нуклеотидов с концов цепи. Так, в пре-РНК с 5'-конца всегда на­ходится АТФ или ГТФ, а с 3'-конца нередко — ГЦ-участки. Они играют важную роль в самом процессе тран­скрипции, но не нужны и даже мешали бы при функционирова­нии зрелой цепи, и поэтому удаляются.

2. С концов цепей отщепляются спейсерные последовательности нуклеотидов (если таковые имеются). Обычно для этого используются эндонуклеазы.

3. Такие пре-РНК, как 45S-пре-рРНК и гистоновая пре-мРНК, разрезаются эндонуклеазами на индивидуальные цепи РНК.

4. Из средних участков пре-тРНК и практически всех (кроме гистоновых) пре-мРНК вырезаются интронные после­довательности. При этом экзонные последовательности сшивают­ся друг с другом в непрерывную цепь. Данный процесс (вырезание интронов и сшивание экзонов) обозначается как сплайсинг.

Очевидно, для его осуществления требуются не только эндо­нуклеазы, но и лигазы (катализирующие соединение экзонов).

Механизм сплайсинга

Один из ключевых моментов механизма сплайсинга (рис.4.11) — обеспечение точности разрезания цепи пре-РНК: ошибка даже на один нуклеотид приведет к «сдвигу рамки», что изменит смысл всех кодонов мРНК или антикодона тРНК.

Рис. 4.11. Механизм сплайсинга.

Е-ферментный комплекс (с нуклеазной и лигазной активностью)

Точность разрезания достигается благодаря двум обстоятельствам. Во-первых, в начале и в конце каждого интрона имеются опре­деленные последовательности нуклеотидов: так, интроны всегда начинаются с Г-У, а кончаются дуплетом А-Г. Во-вто­рых, для узнавания этих последовательностей используются специальные РНК — т. н. малые ядерные РНК (мяРНК). По­следние связаны с ферментами, катализирующими сплай­синг. Такие рибонуклеопротеидные комплексы называются сплайосомами.

Сплайсинг начинается со взаимодействия двух мяРНК с на­чалом и концом интрона. Это дает «ориентацию» для эндону­клеазы: последняя действует на границах двух- и одноцепочечных участков.

Первый разрыв пре-РНК происходит в области 5'-конца ин­трона — на рис. 4.11. это место нахождения левого края левой мяРНК. При этом 5'-конец интрона связывается с одним из ну­клеотидов в средней части того же интрона, что приводит к обра­зованию кольцевой (или, более точно, лассоподобной) структуры.

Поэтому первая (на рисунке — левая) мяРНК, видимо, дис­социирует, а ферментный комплекс перемещается к другой (на рисунке — правой) мяРНК, маркирующей 3'-конец интрона. Здесь происходит второй разрыв пре-РНК — по месту нахожде­ния «правого» конца «правой» мяРНК. Точнее, связь экзона 2 с интроном заменяется на связь с экзоном 1.

Следовательно, оба разрыва совершаются одним и тем же способом — путем замещения одной межнуклеотидной связи на другую такую же связь.

Присоединение и модификация нуклеотидов

В процессе созревания пре-РНК происходит также и не­транскрипционное присоединение отдельных нуклеотидов.

1. В случае пре-мРНК со стороны 5'-конца присоединяется (с помощью нетипичной для полинуклеотидов пирофосфатной связи) 7-метилгуаниловый нуклеотид — компонент «колпач­ка». А со стороны 3'-конца понуклеотидно наращивается поли(А)-фрагмент примерно из 200 нуклеотидов. Для этого ис­пользуются специальные ферменты; в частности, для образова­ния поли(А)-фрагмента — полиаденилатполимераза.

2. В случае пре-тРНК с 3'-конца по очереди присоединяют­ся три нуклеотида — Ц, Ц и А, образующие акцепторную ветвь.

Наконец, важный момент созревания пре-РНК — образова­ние в их составе модифицированных нуклеотидов. Как и в слу­чае метилирования ДНК, минорные нуклеотиды по­являются в полинуклеотидной цепи не на стадии полимериза­ции, а по завершении ее — путем модификации содержащихся в цепи обычных нуклеотидов.

Так, в пре-мРНК происходит метилирование рибозных ос­татков нуклеотидов «колпачка», а в пре-рРНК — тоже метили­рование рибозных остатков, но содержащие их нуклеотиды рас­положены по всей длине цепи — с частотой примерно 1 %.

Гораздо более многообразны процессы модификации в слу­чае пре-тРНК. Например, определенные остатки уридина под­вергаются восстановлению (с образованием дигидроуридина), другие — изомеризации (что дает псевдоуридин), третьи — метилированию (метилуридин). Некоторые остатки аденозина дезаминируются (превращаясь в инозин), причем часть из продук­тов затем еще метилируется (образуя метилинозин). И так да­лее: список происходящих модификаций в пре-тРНК можно продолжить.

Все вышеперечисленные события и приводят в конце кон­цов к образованию в ядре зрелых молекул РНК:

а) 4 –х видов рРНК: 28S-, 18S-, 5,8S- и 5S-РНК;

б) нескольких десятков видов тРНК — по 1-3 (или даже больше) для каждой из 20 аминокислот;

в) тысяч различных мРНК — копий генов, функционирую­щих в данных клетках.

рРНК и мРНК тут же, в ядре, связываются с белками. При этом рРНК формируют с рибосомными белками большие и малые субъединицы рибосом, которые затем выходят в цито­плазму. А мРНК связываются с другими белками (выполняю­щими, видимо, защитную и транспортную функции) и в ком­плексе с ними тоже перемещаются в цитоплазму.

В процессе всех этих преобразований существенно меняют­ся седиментационные свойства. Для иллюстрации приведем ста­дии созревания одной из мРНК (табл. 4.1).

Таблица 4.1. Созревание мРНК

Последовате­льные формы	40 S-пре-мРНК	15 S-пре- мРНК	16,5 S-поли(А)- мРНК	27 S-поли(А)- мРНП
Кол-во нуклеотидов в РНК	~9200	~1200	~1430	~1430
Кол-во связанных молекул белка	—	—	—	3 (с массой по 50.000)

Как видно, в результате удаления «лишних» нуклеотидов цепь пре-мРНК укорачивается примерно на 87 % (т. е. остается лишь 13 % от исходной длины). Затем присоединяются пример­но 230 адениловых нуклеотидов, отчего коэффициент седимен­тации несколько увеличивается. И, наконец, на последней ста­дии он возрастает гораздо сильней — в результате связывания с мРНК трех белковых молекул. В итоге образуется мРНП — м-рибонуклеопротеид, т. е. комплекс мРНК с белками.

Конвейерный характер процесса. До сих пор мы имели в виду одну молекулу РНК-полимеразы и образование одной цепи пре-РНК.

Но в действительности через какое-то время после того, как предыдущая молекула РНК-полимеразы, покинув промотор, продвинется по ДНК на некоторое расстояние, с промотором связывается следующая молекула фермента и тоже начинает транскрипцию.

Поэтому на каждом транскрибируемом гене обычно работа­ют, двигаясь друг за другом, сразу несколько молекул РНК-полимеразы (рис. 4.12).

Рис. 4.12. Транскрипция ДНК одновременно несколькими молекулами

РНК-полимеразы (Е)

Среднее расстояние между ними зависит от «силы» промотора (во многом обусловленной транскрипцион­ными факторами) и концентрации РНК-полимеразы. Пример­ный порядок этого расстояния — 300-500 н. п.

Соответственно, с одним геном одновременно связано нес­колько растущих цепей пре-РНК.

Таким образом, транскрипция гена происходит конвейерным способом.