Экспрессия генов в клетках прокариот в составе плазмид

Основная цель экспериментов по клонированию генов в составе рекомбинантных ДНК, которые предполагается использовать в биотехнологии, – подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. Для этой цели в биотехнологии используют специализированные векторы – экспрессионные (рис. 54) и соответствующие клетки-реципиенты.

Рис. 54. Основные функциональные модули экспрессионного вектора для прокариот

Способность к экспрессии – одно из самых важных свойств гена. За это свойство отвечают различные генетические элементы (последовательности нуклеотидов), которые необходимо встроить в векторную молекулу, несущую ген. Такие последовательности нуклеотидов принято называть регуляторными. Напомним, что к ним относятся последовательности, которые регулируют прочность и точность связывания с молекулой ДНК-матрицы фермента РНК-полимеразы, а также последовательности, сигнализирующие об окончании процесса транскрипции (промотор и терминатор соответственно). Кроме того, синтезируемая в процессе транскрипции мРНК должна содержать в своей структуре последовательности, которые обеспечат ее точное связывание с малой субъединицей рибосомы, тем самым, гарантируя правильную трансляцию. А это требует введения в структуру рекомбинантной ДНК участков, которые получили название сайты связывания рибосом (rbs – ribosome bind site). Упомянутые структурные элементы ДНК обеспечивают также и достаточную копийность как мРНК, так и синтезируемых полипептидов. Также при конструировании экспрессирующихся рекомбинантных ДНК необходимо предусмотреть место в клетке, где будет осуществляться экспрессия вводимых последовательностей ДНК: в цитоплазме в составе плазмидной ДНК или после интеграции в хромосомную ДНК хозяина. Кроме того, в структуре рекомбинантной ДНК должна содержаться информация и о месте локализации в клетке синтезируемого конечного продукта, т.е. белка. Однако, понятие системы экспрессии включает в себя не только структурные модули экспрессирующихся рекомбинантных ДНК, но и особенные характеристики клеток-хозяев, где планируется осуществлять экспрессию. В данном разделе будут рассмотрены некоторые общие моменты, которые необходимо учитывать при выборе системы экспрессии.

Следует отметить, что никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует. В то же время, можно выделить наиболее важные свойства систем экспрессии:

1. Тип промотора и терминатора транскрипции.

2. Прочность связывания мРНК с рибосомой.

3. Число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки).

4. Конечная локализация синтезируемого продукта.

5. Эффективность трансляции в организме хозяина.

6. Стабильность продукта в хозяйской клетке.

В исследовательской работе, а также для производства важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК наиболее часто используют систему экспрессии клеток E.coli. Это связано с тем, что генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганизма детально изучены. Кроме того, это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков.

При рассмотрении генетических векторов для клонирования ДНК (см. раздел векторы) мы познакомились с семейством векторов pUC, в состав которых входят некоторые модули системы α-комплементации лактозного оперона E.coli. Эти регуляторные элементы транскрипции Lac-оперона дают возможность использовать эти векторы для экспрессии в клетках кишечной палочки чужеродных генов. Наличие сильного регулируемого промотора, имеющего большое сродство к РНК-полимеразе, обеспечивает эффективную транскрипцию после наращивания больших количеств клеточной массы.

В системе E.coli для экспрессии клонируемых генов наиболее широко используются следующие регулируемые промоторы: lac- и trp- оперонов E.coli; специально сконструированный tac-промотор, включающий -10- область lac-промотора и -35-область trp-промотора; левый или, pL, промотор бактериофага λ, а также промотор гена 10 бактериофага Т7. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов.

При наличии вклетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. Как правило, многокопийные плазмиды требуют больше энергии, чем малоколийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции клеток утрачивает плазмиды. Лишившиеся своих плазмид клетки обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились. В конечном счете такие клетки оказываются в культуре преобладающими, что через какое-то число генераций отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Чтобы избежать этой проблемы в лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть плазмида. Это приводит к значительному удорожанию конечного продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены не только сохранялись в культивируемых клетках, но и не передавались другим микроорганизмам. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть экологически безопасным. Включение клонированной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без экспрессии в составе плазмид и избежать утраты интересующих исследователя генов.