Факультативные анаэробы.

Способны расти и размножаться как в при­сутствии кислорода, так и в его отсутствии.

Они обладают смешанным типом метабо­лизма. Процесс получения энергии у них мо­жет происходить кислородным дыханием в присутствии кислорода, а в его отсутствии переключаться на брожение. Для этой группы бактерий характерно наличие анаэробного нитратного дыхания.

Различное физиологическое отношение микроорганизмов к кислороду связано с нали­чием у них ферментных систем, позволяющих существовать в атмосфере кислорода. Следует отметить, что в окислительных процессах, протекающих в атмосфере кислорода, при окислении флавопротеидов образуются ток­сические продукты: перекись водорода Н₂0₂ и закислый радикал кислорода 02~ — соеди­нение, имеющее неспаренный электрон. Эти соединения вызывают перекисное окисление

ненасыщенных жирных кислот и окисление SH-групп белков.

Для нейтрализации токсичных форм кисло­рода микроорганизмы, способные существо­вать в его атмосфере, имеют защитные меха­низмы. У облигатных аэробов и факультатив­ных анаэробов накоплению закисного радикала O2~ препятствует фермент супероксиддисмутаза, расщепляющая закисный радикал на перекись водорода и молекулярный кислород:

20₂+2Н⁺ Н₂0₂ + 0₂.

Перекись водорода у этих бактерий разлага­ется ферментом каталазой на воду и молеку­лярный кислород:

2Н₂0₂ -> 2Н₂0 + 0₂.

Аэротолерантные микроорганизмы не име­ют супероксиддисмуиазы, и ее функцию вос­полняет высокая концентрация ионов мар­ганца, который, окисляясь под действием 0₂~, убирает тем самым супероксидный ион. Перекись водорода у этих микроорганизмов разрушается ферментом пероксидазой в ката­лизируемых ею реакциях окисления органи­ческих веществ:

Н₂А + Н₂0₂ ->А + 2Н₂0.

Строгие анаэробы не имеют ни каталазу, ни пероксидазу. Однако супероксиддисума-таза встречается у многих строгих анаэробов. И наличие этого фермента коррелирует с их устойчивостью к кислороду. Некоторые стро­гие анаэробы (роды Bacteroides, Fusobacterium) не выносят присутствия даже незначительного количества молекулярного кислорода, тогда как некоторые представители рода Clostridium могут находиться в атмосфере кислорода. Для культивирования строгих анаэробов создаются условия, позволяющие удалять атмосферный кислород: использование специальных при­боров, анаэростатов и анаэробных боксов, до­бавление в питательные среды редуцирующих кислород веществ, например тиогликолята на­трия, использование поглотителей кислорода.

3.1.7. Рост и способы размножения бактерий Под ростом бактериальной клетки понима­ют согласованное увеличение количества всех компонентов клетки. Рост клетки не беспреде­лен. После достижения критических размеров клетка подвергается делению. Большинство бактерий делится поперечным делением над­вое. У большинства грамположительных бак­терий деление происходит путем синтеза попе­речной перегородки, идущей от периферии к центру. Клетки большинства грамотрицатель-ных бактерий делятся путем перетяжки.

Деление бактериальной клетки начинается спустя некоторое время завершения цикла репликации хромосомы, которая у бактерий протекает по полуконсервативному механиз­му. Это означает, что каждая из двух нитей ДНК хромосомы служит матрицей для синте­за комплементарной дочерней цепи ДНК. В процессе репликации бактериальной хромо­сомы участвует более 20 ферментов. Так как нативная бактериальная ДНК двуспиральная,

перед репликацией цепи родительской моле­кулы матричной цепи ДНК должны быть раз­делены. В этом процессе участвуют ферменты хеликаза, которая в энергопоглошаемой ре­акции расплетает двойную спираль, и то-поизомераза (гираза), которая предотвращает образование вторичных завитков. SSB-белок связывается с одноцепочечной ДНК. предо­твращая повторное скручивание в двойную спираль. В результате образуется репликатив-ная вилка (рис. 3.5). Синтез новых цепей ДНК осуществляется ферментом ДHK-полимеразой. ДНК-полимераза не способна инициировать новые цепи ДНК.

Особенностью функционирования ДНК-поимеразы является ее способность присоеди­нять комплементарные матрице нуклеотиды к свободному З'-концу растущей цепи. Поэтому для осуществления реакции полимеризации нуклеотидов на матрице родительской цепи полимеразе требуется затравка, праймер (prim­er— запал, англ.). Праймер представляет со-

бой короткую нуклеотидную цепочку РНК, комплементарную матричной цепи, со свобод­ным З'-концом. Достраивание осуществляется присоединением к свободной гидроксильной группе З'-конца затравки нового нуклеотида. Расплетенные цепи ДНК всегда содержат на 5'-конце несколько рибонуклеотидов, т. е. син­тез ДНК начинается с синтеза РНК. РНК-за­травку для синтеза ДНК образует специальный фермент ДНК-праймаза, способная иницииро­вать синтез РНК по одноцепочечной ДНК мат­рицы в отсутствие какой-либо затравки. После того как цепь ДНК начала синтезироваться, РНК-затравка удаляется, а удаляющиеся бреши застраиваются ДНК-полимеразой с высокой точностью. Так как цепи ДНК в дуплексе ан-типараллельны, то направление расплетания двойной цепи совпадает лишь с направлением синтеза ДНК на одной матрице, которая на­зывается ведущей и на которой протекает не­прерывный синтез ДНК. На комплементарной цепи ДНК синтезируется короткими фрагмен­тами Оказаки, которые впоследствии сшивают­ся в одну ковалентно связанную непрерывную цепь ДНК ДНК-лигазами.

Процесс репликации ДНК бактерии про­должается до тех пор, пока не удвоится вся ДНК. Репликация начинается в одной из­бранной области, называемой origin (origin — начало, англ.), имеющей определенную пос­ледовательность нуклеотидов. На origin может возникать одна или две репликативные вилки. Последовательность нуклеотидов на origin-участке способствует необходимому для реп­ликации ДНК расплетанию двойной спирали и служит местом «посадки» на ДНК комплек­са ферментов, участвующих в репликации. Правильное распределение вновь синтези­рованных нитей ДНК по дочерним клеткам достигается у бактерий за счет прикрепления ДНК к мембране. Пространственная орга­низация участка прикрепления и зоны роста мембраны, и клеточной стенки обеспечива­ет автоматическое растаскивание двух копий реплицированной Д НК по дочерним клеткам. Размножение бактерий бинарным делением приводит к росту числа бактериальных клеток в геометрической прогрессии.

При внесении бактерий в питательную сре­ду они растут и размножаются до тех пор,

пока содержание какого-нибудь из необхо­димых компонентов среды не достигнет ми­нимума, после чего рост и размножение пре­кращаются. Если на протяжении всего этого времени не прибавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получаем статическую бактериальную куль­туру. Статическая (периодическая) культура бактерий ведет себя как многоклеточный ор­ганизм, с генетическим ограничением роста. Если построить график, по оси абсцисс кото­рого отложить время, а по оси ординат — чис­ло клеток, то получим кривую, описывающую зависимость числа образующихся клеток от времени размножения, которая называется кривой роста(рис. 3.6).

Кривая роста бактерий в жидкой питательной среде.На этой кривой можно различить не­сколько фаз, сменяющих друг друга в опреде­ленной последовательности:

1. Начальная — лаг-фаза (англ. lag — отставать). Охватывает промежуток времени между инокуляцией (посевом бактерий) и на­чалом размножения. Ее продолжительность составляет в среднем 2—5 ч и зависит от со­става питательной среды, от возраста засевае­мой культуры. Во время лаг-фазы происходит адаптация бактериальных клеток к новым условиям культивирования, идет синтез инду-цибельных ферментов.

2. Экспоненциальная (логарифмичес­кая) фаза. Характеризуется постоянной мак­симальной скоростью деления клеток. Эта скорость зависит от вида бактерий и пита­тельной среды. Время удвоения клеток назы-

вается временем генерации, которое варьирует от вида бактериальной культуры: у бакте­рий рода Pseudomonas оно равняется 14 мин, а у Mycobacterium — 24 ч. Величина клеток и содержание белка в них во время экспо­ненциальной фазы остаются постоянными. Бактериальная культура в этой фазе состоит из стандартных клеток.

3. Стационарная фаза. Наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Так как скорость роста зависит от концентра­ции питательных веществ, то при уменьше­нии содержания последних в питательной сре­де уменьшается и скорость роста. Снижение скорости роста происходит также из-за боль­шой плотности бактериальных клеток, сни­жения парциального давления кислорода, накопления токсических продуктов обмена. Продолжительность стационарной фазы со­ставляет несколько часов и зависит от вида бактерий и особенностей их культивирования.

4. Фаза отмирания. Наступает вследствие накопления кислых продуктов обмена или в результате автолиза под влиянием собствен­ных ферментов. Продолжительность этой фа­зы колеблется от десятка часов до нескольких недель.

5. Постоянное нахождение бактериальной популяции в логарифмической фазе роста наблюдается в непрерывной культуре, что до­стигается постепенным дозированием пос­тупления питательных веществ, контролем плотности бактериальной суспензии и удале­нием метаболитов. Непрерывные бактериаль­ные культуры используются в биотехнологи­ческих процессах.

Накопление бактериальной массы (числа бактерий) при культивировании зависит от многих факторов (качество питательных сред, посевная доза, температура выращивания, рН, наличие активирующих рост добавок и др.).

На жидких питательных средах рост и размножение бактерий проявляются в виде диффузного помутнения, образования при­донного осадка или поверхностной пленки. Особенностью размножения бактерий роста Leptospira на жидких средах является отсутс­твие видимых проявлений роста.

На плотных питательных средах бакте­рии образуют скопление клеток — колонии,

которые принято считать потомком одной клетки. Колонии различаются формой, раз­мерами, поверхностью, прозрачностью, кон­систенцией и окраской. Колонии с гладкой блестящей поверхностью принято называть колониями в S-форме (smooth — гладкий, англ.). Колонии с матовой шероховатой по­верхностью называют R-формами {rough — шероховатый, англ.).

Окраска колоний определяется способнос­тью бактерий синтезировать пигменты.

Пигменты различаются по цвету, химичес­кому составу и растворимости. Среди проду­цируемых бактериями пигментов встречают:

— каротиноиды — жирорастворимые пиг­менты красного, желтого и оранжевого цве­тов. Они встречаются у представителей рода Mycobacterium, Micrococcus;

— пирроловые — к ним относится спирто-растворимый пигмент продигиозин, встреча­ющийся у Serratia marcescens;

— фенозиновые — к этой группе относится водорастворимый пигмент Pseudomonas ae-ruginose пиоцианин, который, выделяясь в питательную среду, окрашивает ее;

— меланины — нерастворимые пигменты черного и коричневого цветов, встречающие­ся у бактерий рода Porphyromonas.

Пигменты предохраняют бактериальную клетку от УФ-лучей, обезвреживают токсич­нее кислородные радикалы, обладают анти­биотическими свойствами, принимают учас­тие в реакциях, сопутствующих фотосинтезу в фототрофных бактериях.

Вид, форма, цвет и другие особенности колоний, а также характер роста на плотных питательных средах определяются как кулъ-туральные свойства бактерий и учитываются при их идентификации.

Помимо бинарного деления некоторые представители царства Procaryotae имеют иные способы размножения.

Актиномицеты могут размножаться путем фрагментации гифов. Представители семейс­тва Streptomycetaceae размножаются спорами.

Микоплазмы являются полиморфными бак­териями, что обусловлено особенностями их раз­множения. Помимо поперечного деления, если оно происходит синхронно с синтезом ДНК, ми-

коплазмы могут размножаться почкованием. В этом случае основной морфологической репроду­цирующейся единицей являются элементарные тельца сферической или овоидной формы, раз­множающиеся фрагментацией и почкованием.

Хламидии не обладают способностью к бинар­ному делению. Они проходят через цикл разви­тия, который предусматривает существование двух форм: внеклеточных инфекционных, малых раз­меров элементарных телец, не обладающих спо­собностью к бинарному делению, и внутриклеточ­ного, метаболически активного, крупных размеров ретикулярного тельца, способного к бинарному делению. В результате бинарного деления ретику­лярного тельца формируются дочерние элементар­ные тельца, которые выделяются из клетки.

Некоторые спирохеты, например Treponema pal­lidum, способны образовывать в неблагоприятных условиях цисты, которые, распадаясь на зерна, дают потомство новым бактериальным клеткам.

Некулыпивируемые формы бактерий. Некоторые неспорообразующие бактерии способны переживать неблагоприятные для размножения условия окружающей среды, пе­реходя в некультивируемое состояние. В этом состоянии бактериальные клетки сохраняют свою метаболическую активность, но не спо­собны к непрерывному клеточному делению, необходимому для роста на жидких и плот­ных питательных средах. При смене условии существования, в частности при попадании в организм человека или животных, клетки вновь приобретают способность к размно­жению и сохраняют свой патогенный потен­циал. Переход в некультивируемое (покоя­щееся) состояние обеспечивает сохранение патогенных бактерий в межэпидемические и межэпизоотические периоды. При переходе в некультивируемую форму бактериальные клетки уменьшаются в размерах, приобретают сферическую форму, меняют вязкость ЦПМ. У них сохраняется транспорт электронов по дыхательной цепи и невысокий уровень мета­болической активности. На переход в некуль­тивируемую форму влияют температура, кон­центрация солей, свет, парциальное давление кислорода, содержание питательных веществ, а также метаболиты водорослей, находящихся в биоценозе с бактериями. Выявить наличие

бактерий, находящихся в не культивируемой форме, можно с помощью полимеразной цеп­ной реакции (ПЦР) (разд. 5.6.3) или примене­нием красителей, меняющих окраску в окис­ленной и восстановленной форме. Возврат способности к размножению и росту нахо­дящихся в покоящейся форме клеток могут вызвать естественные факторы: простейшие, обитатели почв и водоемов, фитогормоны, выделяемые корневыми волосками растений.

3.1.8. Условия культивирования бактерий

Для культивирования бактерий необходимо соблюдать ряд условий.

1. Наличие полноценной питательной сре­ды. Каждая питательная среда независимо от сложности состава и цели применения (гл. 2) должна обладать водной основой, органичес­ким источником углерода и энергии, опреде­ленным рН, осмотическим давлением.

2. Температура культивирования. Температура влияет на скорость размножения. К температу­ре бактерии относятся по-разному:

— мезофилы размножаются в диапазоне
температур 20—40 'С. К мезофиллам относит­
ся большинство болезнетворных для человека
бактерий;

— термофи.ш растут в диапазоне температур 40—60 ⁼С. К термофилам относятся актиноми-цеты. некоторые спороносные бациллы;

— психрофилы размножаются в диапазоне температур 0-20 °С.

3. Атмосфера культивирования. Для роста и
размножения строгих аэробов необходим кис­
лород. Аэробы хорошо растут на поверхности
агара на чашках Петри или в тонком верхнем
слое жидкой среды. Для обеспечения роста и
размножения строгих аэробов в глубинных сло­
ях жидкой среды необходимо диффузное рас­
пределение кислорода по всему объему пита­
тельной среды. Это достигается непрерывным
перемешиванием или встряхиванием питатель­
ной среды, т. е. аэрированием. Аэрирование
осуществляется на специальных аппаратах —
встряхивателях.

Для культивирования факультативных ана­эробов используют те же методы, так как в присутствии кислорода у них преобладает ок-сидативный метаболизм над ферментацией, как наиболее энергетически выгодный.

Микроаэрофилы размножаются при пони­женном парциальном давлении кислорода. Этого можно достичь повышением в атмос­фере культивирования парциального дав­ления С0₂ до концентрации 1-5 % против 0,03 % С0₂ в атмосфере воздуха. Для этих же целей используют специальные С0₂-инкуба-торы, или же посевы помещают в эксикаторы, з которых устанавливают горящую свечу.

Облигатные анаэробы для своего роста и размножения требуют исключения доступа кислорода воздуха. Это достигается следую­щими мерами:

—добавлением к питательным средам реду­цирующих кислород веществ: тиогликолевой кислоты, аскорбиновой кислоты, цистеина, сульфидов;

—регенерацией от кислорода воздуха жидких питательных сред путем их кипячения с после­дующим плотным закупориванием сосудов, в которые налиты среды, резиновыми пробками;

—использование поглотителей кислорода, щелочного пирогаллола, и других, помещая их в герметически закрываемые емкости «газ-паки». Этот метод используется для культиви-гювания аэротолерантных бактерий;

—механическим удалением кислорода воз­духа с последующим заполнением емкости инертным газом (для этих целей используют анаэростаты и анаэробные боксы).

Для культивирования ^хемо- и фотоавтот-рофных бактерий создается атмосфера, насы­щенная С0₂.

4. Время культивирования. Зависит от вре­мени генерации. Большинство бактерий куль­тивируют для получения видимого роста в течение 18—48 ч. Для культивирования возбу­дителя коклюша требуется 5 суток, а для куль­тивирования М. tuberculosis — 3—4 недели.

5. Освещение. Для выращивания фототрофных микроорганизмов необходим свет. Некоторые

условно-патогенные микобактерии в зависи­мости от освещенности образуют пигмент, что используется при их идентификации.

Культивирование абсолютных внутрикле­точных паразитов, бактерий, относящихся к родам Rickettsia, Ehrlichia, Coxiella, Chlamydia, осуществляют на культурах клеток или в ор­ганизме животных и членистоногих, а также

в куриных эмбрионах (за исключением эрли-хий). Куриные эмбрионы используют также для культивирования бактерий, обладающих высоким уровнем гетеротрофное™, напри­мер: родов Borrelia, Legionella.

В промышленных условиях для получения биомассы бактерий или грибов с целью по­лучения антибиотиков, вакцин, диагности­ческих препаратов, пробиотиков культивиро­вание осуществляется в аппаратах (фермен­терах) различной вместимости при строгом соблюдении оптимальных параметров роста и размножения культур (гл. 6).