Бактериоскопические методы.

Простая бактериоскопия мазка, окрашенного по Цилю‑Нельсену, в модификации ВОЗ. Мазок из материала фиксируется на пламени спиртовки или разовой горелки, затем окрашивается карболовым раствором фуксина, после чего обесцвечивается 5% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта, что приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур. Затем производится докрашивание 25% раствором метиленового синего. Микобактерии обнаруживаются в виде тонких прямых или слегка изогнутых палочек красного или розового цвета, иногда расположенных в виде римской цифры у Нередко в теле бактерии или отдельно обнаруживаются более темные зерна (зернистые формы) и другие формы изменчивости МБТ. В настоящее время при положительном результате бактериоскопии пишут обнаружены КУБ (кислотоустойчивые бактерии), так как очень редко, но могут встречаться кислотоустойчивые сапрофиты, обычно в моче. При микроскопии мазка, проводимой в микроскопе под иммерсионным объекивом, согласно требованиям ВОЗ, необходим просмотр 100 полей зрения, а в некоторых случаях до 300 в течение 10 мин, что повышает выявляемость и достоверность исследования. В ряде развивающихся стран этот метод является основным при обследованиях на туберкулез. Однако он недостаточно чувствителен (до 10 000‑20 000 микробных тел в 1 мл /мокроты). Для повышения чувствительности используют f методы флотации (применение суспензии материала с более легким, чем вода, углеводородом для всплывания на поверхность микобактерий и микроскопии флотационного кольца) или седиментации (центрифугирование и микроскопия осадка). Наиболее чувствительным является меток люминесцентной микроскопии, когда мазок окрашивается флюоресцирующими красками и микобактерии выглядят в виде светящихся точек в темном поле.

Большое значение имеет бактериологический метод, когда материал засевают на питательную среду и в случае роста культуры МБТ определяют ее чувствительность к противотуберкулезным препаратам. Используются в основном плотные яично солевые питательные среды (жидкие и полужидкие применяются редко), так как на обычных средах микобактерии не растут. В качестве стандартной применяется среда Левенштейна‑Йенсена, а также ее модификации (Гельберга, Финн‑2, Аникина и др.). В настоящее время в Гродненском медицинском университете изучается эффективность более дешевой плотной питательной среды (О. Е. Кузнецов, И. С. Гельберг). При этом возможно выявление МБТ при наличии в 1 мл материала нескольких десятков особей. Изредка при низкой жизнеспособности МБТ в условиях химиотерапии возможно их выявление во время бактериоскопии, обычно люминесцентной, при отсутствии роста на питательной среде.

На плотных питательных средах рост колоний появляется обычно на 3–4 неделе, однако отрицательный ответ выдается через 3 месяца ввиду возможности замедленного роста при снижении жизнеспособности МБТ. В настоящее время большое значение придается не только самому факту выявления МБТ при посеве, но и количественной оценке. По рекомендации Центрального НИИ туберкулеза России, оценка проводится по 3 степеням:

1. скудное – от 1 до 20 колониеобразующих единиц (КОЕ) по числу видимых колоний

2. умеренное – 21–100 КОЕ

3. обильное – более 100 КОЕ.

Величина КОЕ рассчитывается как среднее от числа колоний, выросших во всех пробирках.

Определение лекарственной чувствительности МБТ является неотъемлемой частью бактериологического исследования. Обычно вначале из материала получают рост культуры МБТ, затем их засевают на пробирки со средой, содержащей противотуберкулезные препараты. Устойчивость определяется как снижение чувствительности до такой степени, когда данный штамм микобактерий способен размножаться при концентрации в питательной среде препарата на уровне принятого для него критерия устойчивости (критическая концентрация), например, изониазид 1 мкг/мл, рифампицин 40 мкг/мл и т. д.

Определяется также видовая принадлежность M. tuberculosis или М. bovis и другие при помощи ниацинового теста. Необходимо идентифицировать атипичные микобактерии. К классическим методам идентификации микобактерий относятся: изучение цвета колоний (фотохромогенность и др.). скорость, роста (быстрорастущие относятся к атипичным, чаще сапрофитным группам), температура некоторые атипичные микобактерии, например M. kansasii, М. scrofulaceum, могут расти и при комнатной температуре, хотя и медленнее, а М. avium‑infracellulare и некоторые другие при 22 °С, 37 °С, но также и при 45 °С. Большинство нетуберкулезных микобактерий дают рост в виде S‑колоний (гладких), тогда как М. tuberculosis и М. bovis в виде R‑колоний (шероховатых), для них нехарактерно наличие кос, жгутов на жидких средах. Ниациновый тест основан на том, что микобактерии человеческого вида выделяют значительно больше никотиновой кислоты (ниацина), чем остальные, 417 мкг/мг, в то время как бычьего всего 0,30,9 мкг/мг. Наличие ниацина выявляется с помощью цветной реакции, в том числе на бумажных полосках.

Тест с определением каталазной активности МБТ основан на том, что при прогревании культуры при 68 °С в течение 30 мин она теряется у туберкулезных и сохраняется атипичных микобактерий. При этом следует помнить, что устойчивые к изониазиду МБТ исходно теряют каталазную активность.

К современным методам идентификации относятся молекулярно‑генетические методы пробы ДНК и РНК микобактерий, а также метод хроматографии, значительно ускоряющие исследование. Если ниациновый тест проводится до 6 недель, то Gen Probe на РНК, или хроматография, 1 рабочий день.

В современных условиях определение видовой принадлежности с помощью молекулярно‑биологических методов, выявляющих генетические различия, является наиболее быстрым и занимает 12 дня.

В настоящее время появились автоматизированные системы для обнаружения МБТ и определения их лекарственной чувствительности к основным противотуберкулезным препаратам (ВАСТЕС, BBL MG IT MB/Bact System), которые позволяют выявлять рост МБТ и определять чувствительность к противотуберкулезным препаратам в 23 раза быстрее классических методов. С этой целью используется радиометрический метод, когда в жидкую питательную среду добавляется меченая С¹⁴ пальмитиновая кислота, а выделение микобактерия ми радиоактивного углерода улавливается специальными датчиками. Применяется и радиологический метой, основан на поглощении кислорода растущей культурой МБТ, Снижение его концентрации в камере приводит к появлению флюоресценции и свечения в ультрафиолетовых лучах. Реже используется диалогический метод, заключающийся во введении патологического материала морской свинке, высокочувствительной к туберкулезной инфекции. Современным методом является полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на обнаружении специфической ДНК микобактерий туберкулёза и её фрагментов. Расшифровка последовательностей нуклеотидов ДНК дает возможность их идентифицировать. Суть метода заключается в амплификации (клонировании) определенных специфических локусов ДНК микобактерий и выявлении их при помощи синтетических видоспецифических олигонуклеотидов, называемых праймерами. Такие праймеры в настоящее время синтезированы при помощи компьютерной программы. Обнаруживаются продукты амплификации путем электрофореза при связывании с праймером. Это наиболее чувствительный из существующих методов, позволяющий определять 1–10 микобактериальных клеток в 1 мл материала. Специфичность реакции 97–98%. При помощи ПЦР можно выявить и лекарственную устойчивость. Если традиционными методами лекарственную чувствительность МБТ удается выявить не ранее чем через 1,5–2 месяца, то применение ПЦР позволяет сделать это за несколько (до 2–3)дней. В настоящее время установлен ряд генов в ДНК МБТ, мутации которых ответственны за развитие устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. Выявление этих мутаций производится путем разработки и применения молекулярно‑биологических методов. Число обнаруженных мутаций в генах все время увеличивается и исчисляется многими десятками. Для выявления лекарственной устойчивости МБТ к рифампицину и изониазиду используется метод биологических микрочипов (ТББиочип2004). Лекарственную устойчивость можно выявить у части больных, где при посеве на обычные среды бактериовыделение не обнаруживается. Методу, несомненно, принадлежит большое будущее. В настоящее время его применение сдерживается дороговизной, а также получаемыми изредка ложноположительными результатами.

В настоящее время разработаны методы выявления L‑форм микобактерий туберкулеза бактериоскопические, культуральные с применением селективных питательных сред и др.?