Генетической информации у про- и эукариот

По химической организации материала наследственности и изменчивости эукариотические и прокариотические клетки принципиально не отличаются друг от друга. Генетический материал у них представлен ДНК. Общим для них является и принцип записи генетической информации, а также генетический код. Одни и те же аминокислоты шифруются у про- и эукариот одинаковыми кодонами. Принципиально одинаковым образом у названных типов клеток осуществляется и использование наследственной информации, хранящейся в ДНК. Сначала она транскрибируется в нуклеотидную последовательность молекулы мРНК, а затем транслируется в аминокислотную последовательность пептида на рибосомах с участием тРНК. Однако некоторые особенности организации наследственного материала, отличающие эукариотические клетки от прокариотических, обусловливают различия в использовании их генетической информации.

Наследственный материал прокариотической клетки содержится главным образом в единственной кольцевой молекуле ДНК. Она располагается непосредственно в цитоплазме клетки, где также находятся необходимые для экспрессии генов тРНК и ферменты, часть из которых заключена в рибосомах. Гены прокариот состоят целиком из кодирующих нуклеотидных последовательностей, реализующихся в ходе синтеза белков, тРНК или рРНК.

Наследственный материал эукариот больше по объему, чем у прокариот (см. разд. 3.6.3). Он расположен в основном в особых ядерных структурах —хромосомах (см. разд. 3.5.2), которые отделены от цитоплазмы ядерной оболочкой. Необходимый для синтеза белков аппарат, состоящий из рибосом, тРНК, набора аминокислот и ферментов, находится в цитоплазме клетки.

Значительные отличия имеются в молекулярной организации генов эукариотической клетки. В большинстве из них кодирующие последовательности экзоны прерываются интронными участками, которые не используются при синтезе тРНК, рРНК или пептидов. Количество таких участков варьирует в разных генах. Установлено, что ген оваль-бумина кур включает 7 интронов, а ген проколлагена млекопитающих — 50. Эти участки удаляются из первично-транскрибируемой РНК, в связи с чем использование генетической информации в эукариотической клетке происходит несколько иначе. В прокариотической клетке, где наследственный материал и аппарат биосинтеза белка пространственно не разобщены, транскрипция и трансляция происходят почти одновременно. В эукариотической клетке эти два этапа не только пространственно отделены ядерной оболочкой, но и во времени их разделяют процессы созревания мРНК, из которой должны быть удалены неинформативные последовательности (рис. 3.35).

Рис. 3.35. Обобщенная схема процесса экспрессии генетической информации

в эукариотической клетке

Кроме указанных различий на каждом этапе экспрессии генетической информации можно отметить некоторые особенности течения этих процессов у про- и эукариот.

Транскрипция у про- и эукариот. Транскрипция — это синтез РНК на матрице ДНК. У прокариот синтез всех трех видов РНК катализируется одним сложным белковым комплексом — РНК-полимеразой.

Транскрипционный аппарат эукариотических клеток включает три ядерные РНК-полимеразы, а также РНК-полимеразы митохондрий и пластид. РНК-полимераза I обнаруживается в ядрышках клеток и отвечает за транскрипцию генов рРНК. РНК-полимераза II локализуется в ядерном соке и отвечает за синтез предшественника мРНК. РНК-полимераза III —небольшая фракция, находящаяся в ядерном соке и осуществляющая синтез малых рРНК и тРНК. Каждый из этих ферментов имеет две большие субъединицы и до 10 малых. РНК-полимеразы митохондрий и пластид отличаются от ядерных.

Ферментный комплекс РНК-полимеразы специфически узнает некую нуклеотидную последовательность (часто не одну), расположенную на определенном расстоянии от стартовой точки транскрипции, — промотор. Стартовой точкой считают нуклеотид ДНК, которому соответствует первый нуклеотид, включаемый ферментом в РНК-транскрипт.

У прокариот обычно недалеко от стартовой точки против хода транскрипции располагается последовательность из шести нуклеотидов — ТАТААТ, называемая блоком Прибнова. Это среднестатистическая последовательность, состоящая из наиболее часто встречаемых оснований, самыми консервативными из которых являются 1,2 и 6-е основания. Наличие в этой последовательности оснований, преимущественно соединенных двойными водородными связями с комплементарными основаниями другой цепи, очевидно, облегчает локальное плавление двойной спирали ДНК и образование двух ее одноцепочечных участков при контакте с РНК-полимеразой. Блок Прибнова располагается в положении от —11 до —5 или от —14 до —8, т.е. за несколько нуклеотидов перед стартовой точкой транскрипции (рис. 3.36). Обнаруживая эту последовательность, РНК-полимераза прочно связывается с ней и начинает синтез РНК.

Столь же важная роль в установлении контакта РНК-полимеразы с ДНК принадлежит другой нуклеотидной последовательности, центр которой находится в положении —35. Ее называют областью узнавания —ТТГАЦА. Между двумя указанными участками расстояние достаточно постоянно и составляет от 16 до 19 пар нуклеотидов (п.н.).

Промоторы эукариотических генов также включают по меньшей мере две специфические нуклеотидные последовательности, центры которых находятся в положении —25 и —75 п.н. На расстоянии 19—27 нуклеотидов от стартовой точки против хода транскрипции у многих генов эукариот обнаружена среднестатистическая последовательность ТАТ^А_ТА^А_Т (ТАТА-блок, или блок Хогнесса), в которой, так же как в блоке Прибнова у прокариот, преобладают основания, образующие более слабые связи.

Вторую последовательность, встречаемую во многих промоторах эукариот и состоящую из ГГ^Ц_ТЦААТЦТ, обозначают как ЦААТ-блок. Она занимает положение между —70 и —80 нуклеотидами и также является областью, узнаваемой полимеразой.

В некоторых генах обнаружены многокомпонентные промоторы. Так, в отдельных генах вируса герпеса для эффективной инициации транскрипции необходимы три последовательности ДНК, расположенные между —19 и —27, между —47 и —61, а также между —80 и —105 нуклеотидами.

Рис. 3.36. Точки контакта для РНК-полимеразы,

находящиеся в верхней цепи ДНК (промотор)

Особенности промоторных участков свидетельствуют о том, что для инициации транскрипции имеет значение не только сочетание оснований в определенных областях промотора, но и взаимное расположение в молекуле ДНК этих областей, с которыми связывается ферментный комплекс РНК-полимеразы.

После установления контакта между РНК-полимеразой и промоторным участком начинается сборка молекулы РНК, в которую первым чаще всего включается нуклеотид, несущий пуриновое основание (как правило, аденин) и содержащий три 5'-фосфатных остатка. Далее, по мере продвижения РНК-полимеразы вдоль молекулы ДНК происходит постепенное удлинение цепи РНК, которое продолжается до встречи фермента с областью терминатора (см. разд. 3.4.3.1). Терминатор — это участок, где прекращается дальнейший рост цепи РНК и происходит ее освобождение от матрицы ДНК. РНК-полимераза также отделяется от ДНК, которая восстанавливает свою двухцепочечную структуру.

Рис. 3.37. Область ДНК с двойной симметрией —палиндром:

I — палиндром, в котором имеется последовательность, одинаковая при чтении в противоположных направлениях;

II — палиндром, в котором заштрихованный инвертированный повтор находится на расстоянии от оси симметрии

В прокариотических клетках терминаторы обязательно содержат палиндромы — двухцепочечные последовательности нуклеотидов ДНК, которые одинаково читаются в обоих направлениях (рис. 3.37). Участок РНК, транскрибированный с такой последовательности, способен образовывать двухцепочечные шпильки за счет комплементарного спаривания нуклеотидов палиндрома. Возможно, это и является сигналом для завершения транскрипции, узнаваемым РНК-полимеразой (рис. 3.38). Возникающие шпильки, видимо, останавливают полимеразу на терминаторе. Следом за шпилькой в молекулу РНК включается последовательность из нуклеотидов, содержащих урацил (полиУ), которая, вероятно, принимает участие в высвобождении РНК от матрицы ДНК. Действительно, полиУ-последовательность РНК, соединенная с полиадениловой (полиА) последовательностью ДНК, характеризуется слабым взаимодействием. Обращает на себя внимание тот факт, что участок ДНК, богатый парами А-Т, встречается не только в месте инициации транскрипции (блок Прибнова), но и в терминаторной области.

Бактериальные терминаторы значительно различаются по своей эффективности. Некоторые из них как бы не замечаются РНК-полимеразой, и она продолжает транскрипцию за пределами терминатора. Такое прочитывание терминатора при транскрипции бактериальных генов наблюдается в результате предотвращения терминации специфическими белками — факторами антитерминацш. Следствием антитерминации является синтез полицистронной мРНК, включающей в себя информацию, списанную с нескольких последовательно расположенных структурных генов.

Терминаторы эукарйогических генов изучены в меньшей степени, чем у проскариот, но в них также обнаружены районы, богатые Г-Ц парами, соединенными тройными водородными связями, в которых располагается, участок с А-Т парами. На этом участке в транскрипт включается полиУ-последовательность, слабо взаимодействующая с матричной полиА-областыо ДНК.

Возможно, область терминатора, богатая Г-Ц парами, играет определенную роль в остановке РНК-полимеразы, а участок РНК, содержащий УУУУ обеспечивает отделение транскрипта от матрицы ДНК.

У эукариот не обнаружено образования структур, подобных шпилькам в прокариотических РНК. Поэтому, каким образом у них осуществляется терминация транскрипции, остается неясным.

В составе всех мРНК можно выделить кодирующие участки, представляющие набор кодонов, которые шифруют последовательность аминокислот в пептиде. Как правило, эти участки начинаются стартовым кодоном АУГ, но иногда у бактерий используется кодон ГУТ. На конце кодирующей последовательности располагается терминирующий кодон. Помимо кодирующих участков в мРНК на обоих концах могут располагаться дополнительные последовательности. На 5'-конце это лидерный участок, расположенный перед стартовым кодоном. На 3'-конце — трейлер, следующий за кодоном-терминатором.

Рис. 3.38. Образование шпильки участком РНК

при терминации транскрипции у прокариот

Область РНК, несущая палиндром, образует комплементарно спаривающуюся структуру — шпильку (инвертированные повторы заштрихованы)

В полицистронной мРНК прокариот между кодирующими участками имеются межцистронные области, варьирующие по размерам (рис. 3.39).

Рис. 3.39. Полицистронная матричная РНК прокариот:

1 — некодирующие области, 2 — межцистронные области, 3 — кодирующие области, 4 — терминирующие кодоны

В связи с тем что прокариотические гены целиком состоят из нуклеотидных последовательностей, участвующих в кодировании информации, транскрибированные с них РНК сразу после их синтеза способны выполнять функцию матриц для трансляции. Лишь в исключительных случаях требуется их предварительное созревание — процессинг.

В отличие от прокариотических генов большинство генов эукариотических клеток прерывисты, так как несут в своем составе неинформативные нуклеотидные последовательности — интроны, не участвующие в кодировании информации. В связи с этим первичные транскрипты, синтезированные РНК-полимеразой II, обладают большими, чем необходимо для трансляции, размерами и оказываются менее стабильными. В совокупности они образуют так называемую гетерогенную ядерную РНК(тяРНК), которая прежде чем выйти из ядра и начать активно функционировать в цитоплазме, подвергается процессингу и превращается в зрелые мРНК.

Процессинг эукариотических мРНК. Созревание, или процессинг, мРНК предполагает модифицирование первичного транскрипта и удаление из него некодирующих интронных участков с последующим соединением (сплайсингом) кодирующих последовательностей — экзонов. Модифицирование первичного транскрипта эукариотической мРНК начинается вскоре после синтеза его 5'-конца, содержащего одно из пуриновых оснований (аденин или гуанин). На этом конце образуется колпачок — кэп, который блокирует 5'-конец мРНК путем присоединения к первому нуклеотиду транскрипта трифосфонуклео-зида, содержащего гуанин, связью 5'—5'

Гффф + фффАфN… → ГфффАфN..+ фф +ф

В результате образуется последовательность ГфффАфЧМ..., в которой остаток туанина находится в обратной ориентации по отношению к другим нуклеотидам мРНК. Модификация 5'-конца мРНК предполагает также метилирование присоединенного гуанина и первых двух-трех оснований первичного транскрипта (рис. 3.40). Образуемые на 5' -концах мРНК кэпы обеспечивают узнавание молекул мРНК малыми субчастицами рибосом в цитоплазме. Кэширование осуществляется еще до окончания синтеза первичного транскрипта.

Рис. 3.40. Образование зрелой мРНК эукариот в ходе процессинга:

1 — некодирующие последовательности, 2 — экзоны, 3 — интроны, 4 — кодон-терминатор

После завершения транскрипции происходит удаление части нуклеотидов на 3'-конце первичного транскрипта и присоединение к нему последовательности, состоящей из 100—200 остатков адениловой кислоты (полиА) (рис. 3.40). Считают, что эта последовательность способствует дальнейшему процессингу и транспорту зрелой мРНК из ядра. После выхода мРНК в цитоплазму ее полиА-последовательность постепенно укорачивается под действием ферментов, отщепляющих нуклеотиды на 3'-конце. Таким образом, по длине полиА-последовательности можно косвенно судить о времени пребывания мРНК в цитоплазме. Возможно, добавление полиА-последовательности в ходе процессинга повышает стабильность мРНК. Однако около трети мРНК вообще не содержат полиА-участка. К ним относятся, например, гистоновые мРНК.

Образование кэпа на 5'-конце и полиА-последовательности на 3'-конце характерно только для процессинга РНК, синтезируемых РНК-полимеразой II. Кроме метилирования при формировании кэпов в мРНК высших эукариот происходит метилирование небольшой части внутренних нуклеотидов с частотой приблизительно одно на тысячу оснований мРНК.

Наряду с модифицированием мРНК эукариот процессинг предполагает удаление из первичных транскриптов неинформативных для данного белка интронных участков, размер которых варьирует от 100 до 10 000 нуклеотидов и более. На долю интронов приходится около 80% всей гяРНК. Удаление интронов с последующим соединением экзонных участков называют сплайсингом (рис. 3.40).

Сплайсинг представляет собой механизм, который должен обеспечивать удаление из первичного транскрипта строго определенных интронных участков. Нарушение этого процесса может привести к сдвигу рамки считывания при трансляции и невозможности синтеза нормального пептида. Закономерность вырезания интронов, очевидно, обеспечивается благодаря наличию на их концах специфических нуклеотидных последовательностей, служащих сигналами для сплайсинга.

В настоящее время описано несколько вероятных механизмов сплайсинга, обеспечивающих точность этого процесса. Возможно, она достигается действием каких-то ферментов, специфически узнающих концевые участки интронов и катализирующих разрыв фосфодиэфирных связей на границе экзон — интрон, а затем образование связей между двумя экзонами.

Установлено активное участие в сплайсинге особых малых, ядерных РНК (мяРНК), образующих комплексы с белками (мяРНП). Очевидно, мяРНК своими нуклеотидными последовательностями комплементарно взаимодействуют с концевыми участками интронов, которые образуют при этом замкнутые петли. Расщепление РНК в устье интронной петли приводит к удалению неинформативной последовательности и соединению (сплайсингу) сближенных концов экзонов.

Обсуждается также автокаталитическая способность РНК-транскрипта к сплайсингу. Описанные способы сплайсинга свидетельствуют об отсутствии универсального механизма этого процесса, однако во всех случаях достигается точное удаление интронов с образованием определенной мРНК, обеспечивающей синтез необходимого клетке белка.

В настоящее время доказана возможность альтернативного (взаимоисключающего) сплайсинга, при котором из одного и того же первичного транскрипта могут удаляться разные нуклеотидные последовательности и образовываться разные зрелые мРНК. В результате одна и та же последовательность нуклеотидов ДНК может служить информацией для синтеза разных пептидов. Альтернативный сплайсинг, вероятно, очень характерен в системе генов иммуноглобулинов у млекопитающих, где он позволяет формировать на основе одного транскрипта мРНК для синтеза разных видов антител.

Благодаря преобразованиям, происходящим с РНК-транскриптом в ходе процессинга, зрелые мРНК эукариот характеризуются большей стабильностью по сравнению с прокариотическими мРНК.

По завершении процессинга зрелая мРНК проходит отбор перед выходом в цитоплазму, куда попадает всего 5% гяРНК. Остальная часть расщепляется, не покидая ядра.

Таким образом, преобразования первичных транскриптов эукариотических генов, обусловленные их экзон-итронной организацией и необходимостью перехода мРНК из ядра в цитоплазму, определяют особенности реализации генетической информации в эукариотической клетке.

Трансляция у про- и эукариот. В прокариотических клетках процесс трансляции сопряжен с синтезом мРНК: они происходят практически одновременно. В значительной степени это связано с недолговечностью бактериальной мРНК, которая достаточно быстро подвергается распаду. Взаимосвязанность транскрипции и трансляции у бактерии проявляется в согласованности скоростей этих процессов. При 37°С транскрипция идет со скоростью 2500 нуклеотидов/мин (14 кодонов/с), а трансляция осуществляется со скоростью 15 аминокислот/с.

Трансляция у прокариот начинается вскоре после образования 5'-конца мРНК, раньше, чем заканчивается ее синтез. В результате вслед за РНК-полимеразой по мРНК движутся рибосомы, осуществляющие сборку пептидных цепей (рис. 3.41). Через некоторое время после начала транскрипции (около 1 мин) и до завершения трансляции 3'-конца матрицы начинается деградация ее 5'-конца. Ввиду того что время жизни разных мРНК не одинаково, количество белка, синтезированного на разных матрицах, различно.

Одной из особенностей трансляции у прокариот является включение в пептидную цепь в качестве первой аминокислоты модифицированного метионина — формилметионина, с которого начинаются все вновь синтезированные пептиды. Даже в том случае, когда роль стартового кодона выполняет кодом ГУГ, в обычных условиях шифрующий валин, в первом положении пептида оказывается формилметионин. Стартовый кодон АУГ или ГУГ следует за лидерным участком, который экранируется рибосомой в момент инициации трансляции.

Соединение рибосомы с мРНК обусловлено комплементарным взаимодействием нуклеотидов одной из рРНК с нуклеотидной последовательностью лидера мРНК.

Эта последовательность (Шайна—Дальгарно) располагается на расстоянии 4—7 оснований перед кодоном АУГ и обнаруживается повсеместно в лидерных участках у прокариот.

При соединении 5'-конца мРНК с малой субчастицей рибосомы стартовый кодон обычно оказывается почти в середине экранированного рибосомой фрагмента мРНК, в области, соответствующей ее П-участку.

У эукариот трансляция осуществляется в цитоплазме, куда попадает из ядра зрелая мРНК. Копированный конец мРНК распознается малой субчастицей рибосомы, затем лидирующая последовательность, содержащая до 100 нуклеотидов, взаимодействует с рРНК. При этом стартовый кодон АУГ оказывается в недостроенном П-участке рибосомы. После присоединения к стартовому кодону аминоацил-тРНК, несущей метионин, происходит воссоединение двух субчастиц рибосомы и формируются ее А- и П-участки. Синтез белка в эукариотической клетке, осуществляемый на моноцистронной мРНК, завершается после прохождения рибосомой по всей мРНК, вплоть до узнавания ею кодона-терминатора, прекращающего образование пептидных связей.

Посттрансляционные преобразования белков. Синтезированные в ходе трансляции пептидные цепи на основе своей первичной структуры приобретают вторичную и третичную, а многие—и четвертичную организацию, образуемую несколькими пептидными цепями. В зависимости от функций, выполняемых белками, их аминокислотные последовательности могут претерпевать различные преобразования, формируя функционально активные молекулы белка.

Многие мембранные белки синтезируются в виде пре-белков, имеющих на N-конце лидерную последовательность, которая обеспечивает him узнавание мембраны. Эта последовательность отщепляется при созревании и встраивании белка в мембрану. Секреторные белки также имеют на N-конце лидерную последовательность, которая обеспечивает их транспорт через мембрану.

Некоторые белки сразу после трансляции несут дополнительные аминокислотные про-последовательности, определяющие стабильность предшественников активных белков. При созревании белка они удаляются, обеспечивая переход неактивного пробелка в активный белок. Например, инсулин вначале синтезируется как пре-проинсулин. Во время секреции пре-последовательность отщепляется, а затем проинсулин подвергается модификации, при которой из него удаляется часть цепи и он превращается в зрелый инсулин.

Рис. 3.41. Транскрипция, трансляция и деградация мРНК у прокариот:

I — РНК-полимераза связывается с ДНК и начинает синтезировать мРНК в направлении 5' → 3';

II — по мере продвижения РНК-полимеразы к 5'-концу мРНК прикрепляются рибосомы, начинающие синтез белка;

III — группа рибосом следует за РНК-полимеразой, на 5'-конце мРНК начинается ее деградация;

IV —процесс деградации протекает медленнее, чем транскрипция и трансляция;

V — после окончания транскрипции мРНК освобождается от ДНК, на ней продолжается трансляция и деградация на 5'-конце

Формируя третичную и четвертичную организацию в ходе посттрансляционных преобразований, белки приобретают способность активно функционировать, включаясь в определенные клеточные структуры и осуществляя ферментативные и другие функции.

Рассмотренные особенности реализации генетической информации в про- и эукариотических клетках обнаруживают принципиальное сходство этих процессов. Следовательно, механизм экспрессии генов, связанный с транскрипцией и последующей трансляцией информации, которая зашифрована с помощью биологического кода, сложился в целом еще до того, как были сформированы эти два типа клеточной организации. Дивергентная эволюция геномов про- и эукариот привела к возникновению различий в организации их наследственного материала, что не могло не отразиться и на механизмах его экспресии.

Постоянное совершенствование наших знаний об организации и функционировании материала наследственности и изменчивости обусловливает эволюцию представлений о гене как функциональной единице этого материала.